Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

Todos los protocolos para los experimentos con ratones discutidos aquí estaban de acuerdo con las directrices institucionales y aprobados por el Comité de ética de investigación humana institucional del Centro Médico Mount Sinai y el Comité de Cuidado y Uso de Animales. 1. Procesamiento de la muestra de tejido del sarcoma y la formación PDX Bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional, pida al personal del servicio de patología que prepare muestras de sarcoma de muestras de cirugía e coloque inmediatamente cada muestra en hielo en un plato Petri de 100 mm. Coloque la muestra en un tubo cónico de poliestireno de 15 ml con 6 ml de medio de cultivo frío Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina. Procesar la muestra de tejido inmediatamente. (Opcional) Solo para el osteosarcoma, siga los siguientes pasos, que se pueden omitir para el sarcoma de tejidoblando. Cortar el tejido en 20 mm3 piezas usando un bisturí. Transfiera las piezas de tejido a un tubo de 15 ml que contenga 3 ml de solución de colagenasa (RPMI 1640 con 1 mg/ml de colagenasa). Poner el tubo en un baño de agua a 37 oC durante 30 minutos. Vórtice a fondo el tubo y, a continuación, añadir 3 mL de RPMI 1640 complementado con 10% FBS para neutralizar la actividad de la colagenasa. Centrífuga durante 5 min a 350 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante. Trabajando en un gabinete de bioseguridad estéril, coloque la muestra de tejido en un plato Petri de 100 mm. Añadir 500 l de solución salina estéril 1x con fosfato (PBS) al tejido. Con un bisturí estéril, triturar mecánicamente el tejido en trozos pequeños hasta que ninguna pieza de tejido visible sea mayor de 0,1 mm. Transfiera la suspensión celular de 500 ml a un colador de células de 35 m y recoja la suspensión filtrada con un tubo de poliestireno de 50 ml. Ponga este tubo de poliestireno de 50 ml con la suspensión celular sobre hielo. Añadir otros 500 l de PBS al tejido. Triturar por segunda vez, transferir la suspensión a través del colador de la célula, y recogerla en el mismo tubo de 50 ml. Repita estos pasos (pasos 1.5–1.6) hasta que la sección del tejido esté completamente disociada, generalmente 6x – 8x. Pellet la suspensión celular por centrifugación a 350 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet usando 5 ml de tampón de hemólisis (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3y 0,1 mM EDTA), e incubar la solución durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los glóbulos rojos. Centrifugar durante 5 min a 350 x g a temperatura ambiente y eliminar el tampón de hemólisis. Lavar el pellet con 5 ml de PBS. Centrifugar de nuevo durante 5 min a 350 x g y quitar el sobrenadante. Resuspenda el pellet con 1 ml de PBS y cuente el número de celda viable usando un hemocitómetro o cualquier otro método alternativo. Diluir las células a una concentración final de 1 x 107 células en 200 l de PBS. Deje la suspensión de la celda sobre hielo. Deje la matriz de membrana del sótano sobre hielo para permitir que se derrita. Añadir 200 l de matriz de membrana de sótano a la suspensión celular de 200 l. Mezcle suavemente y mantenga en hielo. Inyección subcutánea de la suspensión celular: matriz de membrana de sótano (1:1) mezcla en dos ratones NOD scid gamma (NSG) en sus flancos. Utilice 200 l para cada inyección. Supervise la formación de PDX comprobando el lugar de inyección de los ratones 2 veces por semana. Retire el xenoinjerto tumoral cuando alcance 1 cm de diámetro. 2. Aislamiento de células que inician tumores por FACS del PDX Retire quirúrgicamente el PDX de los ratones como se describió anteriormente12. Corta el tumor por la mitad. Fije la mitad del xenoinjerto con 4% de paraformaldehído durante la noche. Esto es para análisis histológico. Procesar la otra mitad del tejido como se describió anteriormente (pasos 1.3–1.8) para obtener una suspensión de la célula tumoral. Resuspenda el pellet con PBS y cuente el número de celda viable. Diluir la suspensión celular en PBS suplementada con 5% FBS a una concentración de 2 x 106 células/ml. Deje la suspensión celular sobre hielo durante 30 minutos. Marque los tubos con control de isótopos y anticuerpos, respectivamente. Observe el número de células en cada tubo. Preparar 2 x anticuerpo HLA-1-PE diluyendo el anticuerpo con PBS complementado con 5% DE FBS (1:250). Diluir el anticuerpo de control de isotipo negativo con la misma condición. Mezclar la suspensión celular del tubo “anticuerpo” con anticuerpos diluidos (1:1) para hacer la dilución final del anticuerpo 1:500. Mezclar la suspensión celular del tubo de “control de isótopos” con el control de isótopos (1:1). Ponga las suspensiones de celdas en hielo durante 90 min. Centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4oC y retira el sobrenadante. Añadir 10 mL de PBS para lavar el pellet 2x. Añadir 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a PBS a una concentración final de 10 g/ml. Agregue esta solución DAPI al pellet celular para hacer una suspensión celular de 107 células/ml (usando los números de celda del paso 2.4). Filtrar la suspensión de la célula a través de tapas de colador de 35 mm en tubos de poliestireno de 12 mm x 75 mm. Utilice un citómetro de flujo para ordenar la subpoblación TIC HLA-1-negativa6. Las células viables de la puerta (DAPI-negativa) y recoger las subpoblaciones HLA-1-negativas y -positivas en dos tubos de recolección de 15 ml, cada uno con teniendo 4 ml de medio de cultivo RPMI 1640. 3. Caracterización de las células que inician tumores Formación de la sarcosfera Haga que la sarcosfera sea mediana de crecimiento, utilizando un medio de cultivo celular alfa-MEM. Añadir suplementos para hacer una concentración final de suplementos de B-27 (1x), Suplementos de N2 (1x), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (20 ng/ml), y factor de crecimiento epidérmico (EGF) (20 ng/ml) y penicilina/estreptomicina (100 UI/ml). Filtre el medio con un filtro de cultivo celular de 0,2 m antes de su uso. Pellet la subpoblación hLA-1-negativa y positiva ordenada del paso 2.9 y contar los números de célula de cada subpoblación. Diluir 1,5 x 106 células en 15 ml del medio de crecimiento de la sófera para hacer la dilución celular de 1 x 105 células/ml. Diluir en serie las células con medio de crecimiento de sórtica fresca para hacer 15 ml de dilución celular de 104, 103y 102 células/ml. Luego, prepare cuatro placas de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos, cada una para una dilución celular. Transfiera 100 ml de suspensión celular de la dilución de 105 células/ml a cada pocal de la primera placa de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos. Esta placa tiene 104 células en cada pozo. Utilice las otras tres placas de cultivo de células de unión ultrabaja de 96 pocillos para las otras tres diluciones celulares: 104, 103y 102 células/ml. Transfiera 100 l de suspensión celular a cada pocal de las placas de cultivo de células de fijación ultrabaja de 96 pocillos. Estas tres placas de cultivo tienen 1.000 células/pozo, 100 células/pozo, y 10 células/pozo, respectivamente. Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular de 37 oC y 5% de CO2. Añadir nuevos bFGF y EGF directamente al medio de cultivo celular (concentración final de 20 ng/ml) cada tres días sin cambiar el medio para evitar las células perdidas en el cultivo de suspensión. Usando un microscopio de luz, monitoree la formación de la sarcosfera todos los días durante tres semanas, como se muestra en la Figura 2A. Después de tres semanas, cuente el número de pozos positivos de la sarcásfera y los pozos negativos de la sarcásfera de cada dilución celular para células HLA-1-negativas y HLA-1-positivas. Calcular la frecuencia de celda de formación de esferas basada en una distribución de probabilidad de Poisson13. Compare los TIC HLA-1 negativos con las células a granel positivas de HLA-1. Ensayo de formación de tumores de dilución en serie Cuente las subpoblaciones HLA-1-negativas y -positivas del paso 2.9. Hacer diluciones en serie de las células con PBS a concentraciones de 106, 105, 104y 103 células/ml. Utilice 1 ml de cada dilución para la formación de tumores en 10 ratones. Añadir 1 ml de matriz de membrana del sótano a la suspensión celular de 1 ml de cada dilución (1:1). Conservar los 2 ml de cada mezcla sobre hielo. Inyección subcutánea de 200 l de la célula:mezcla de matriz de membrana de sótano en los flancos de ratones NGS, utilizando células HLA-1-negativas para un flanco y células HLA-1-positivas para el otro flanco del mismo ratón. Para cada dilución, utilice 10 ratones. Utilice jeringas 25G con una aguja para las inyecciones. Controlar la formación de tumores en ratones durante cuatro a ocho semanas, dependiendo de la tasa de crecimiento del tumor. Calcular la frecuencia celular que inicia el tumor por el porcentaje de formación de tumores en diferentes números de células de entrada. Compare los TIC HLA-1 negativos con las células a granel positivas de HLA-1. Diferenciación inducida a lo largo de las vías mesenquimales Utilice las sarcáselas formadas durante los pasos anteriores (paso 3.1.9). Transfiera las sarcáselas a una nueva placa de 6 pocillos. Cultivo de la sórsfera con 2,5 ml de alfa-MEM complementado con 10% FBS para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa de cultivo. Después de un accesorio durante dos días, cambie el medio de cultivo de alfa-MEM complementado con 10% FBS a la mezcla 1:1 de alfa-MEM complementado con 10% FBS y medio de crecimiento de células madre mesenquimales humanas (hMSC). Después de dos días, cambie a medio de crecimiento hMSC completo. Cuando las células alcancen una confluencia del 90%, aspire el medio hMSC y agregue un medio de diferenciación. Para la diferenciación osteogénica, añadir medio de diferenciación osteogénica (medio de crecimiento hMSC complementado con 10 nM dexametasona, 5 mM de glicerofosfato, ácido L-ascórbico de 50 g/ml y cloruro de litio de 10 mM). Para la diferenciación lipogénica, añada el medio de diferenciación de adipocitos (medio de crecimiento hMSC complementado con dexametasona de 0,5 m, isobutilometilxantina de 0,5 m y 50 m de indometacina). Cambie el medio de diferenciación cada tres días. Después de tres a cuatro semanas, deje de diferenciar y lave las células con PBS. Luego, aspirar el PBS y agregar 2 mL de 10% de formalina a las células para la fijación. Deje que las células se sentén durante 45 minutos a temperatura ambiente. Lávelos con agua desionizada. Las células ya están listas para la tinción de Alizarin Red S (paso 3.3.6.1) o la tinción de Aceite Rojo O (paso 3.3.6.2). Para detectar la diferenciación osteogénica, realice la tinción de Alizarin Red S. Aspirar agua y añadir 2 mL de solución de trabajo Alizarin Red S (2% Alizarin Red S, pH 6.0) a las células, y dejarlas sentar durante 5 minutos para la tinción. Lavar las células con agua desionizada y observar la reacción microscópicamente. Para detectar la diferenciación adipogénica, realice la tinción de aceite rojo O. Haga una solución de Aceite Rojo O. Preparar una solución en stock añadiendo 300 mg de aceite rojo O en polvo a 100 ml de isopropanol. Dentro de 2 h antes de usar, mezcle tres partes (30 ml) de la solución de stock de aceite rojo O con dos partes (20 ml) de agua desionizada. Deje que la mezcla se situya durante 10 minutos a temperatura ambiente. Filtre la solución de trabajo antes de su uso. Retire el agua de las células preparadas según el paso 3.3.6. Añadir 2 mL de 60% isopropanol para cubrir la monocapa celular y las células se sentan durante 2 min. Retire el isopropanol y agregue 2 ml de solución de trabajo Oil Red O. Deje que las células se sit durante 5 minutos a temperatura ambiente. Enjuague las células con agua desionizada y observe la reacción bajo un microscopio de luz.