Immunostaining para modificaciones de ADN: análisis computacional de imágenes confocales

Consiste en un mecanismo documentado asociado con la regulación transcripcional metilación del ADN, modificación de residuos de citosina en 5′-citosina-fosfato-guanina-3′ contexto de dinucleótido (CpG) mediante la adición de un grupo metilo (-CH₃) a la 5 – átomo de carbono del anillo de pirimidina citosina para formar 5-METILCITOSINA (5mC)¹. En los mamíferos, aproximadamente el 70% de GPC son metilado que constituye sólo el 1% de sus genomas se agotan de esta secuencia palindrómico debido a 5mC mutagénicos propensión a deaminate espontáneamente a timina². Presencia de grupos metilo en las secuencias del gene promotor Mostrar correlación fuerte con la represión transcripcional en vertebrados^3,4,5. Además de estos grupos metilo es catalizada por altamente conservado ADN metiltransferasa (DNMT) enzimas DNMT3a, 3b y 3 L y DNMT1 que modificar CpG cytosines en contextos de metilación de novo y mantenimiento respectivamente⁶. Expresión DNMT3A/B es elevada durante el desarrollo de las células madre embrionarias y epiblasto; sin embargo su expresión disminuida se observa después de pluripotent células linaje compromiso destinos somáticos durante diferenciación⁸. Compartiendo redundancia funcional, DNMT3a y 3b muestran patrones de expresión tejido específica, con 3a detectado uniformemente en embriones de ratón pero 3b localizada predominantemente en neuroectodermo y el ectodermo coriónica tejidos⁸.

Firmas de metilación pueden ser heredadas durante mitosis y meiosis¹⁰. Metilación de mantenimiento implica la DNMT1 facilitados modificación de residuos de citosina GPC existentes en hemi-metilados palíndromos en la doble hebra de ADN¹¹. DNMT1 se une ADN en replicación horquillas¹¹ y por lo tanto, los niveles de metilación genómica pico durante la fase S del ciclo celular¹². DNMT1 son methylates cytosines sin modificar lo distinción de hebras de ADN recién sintetizados, promoción de inactivación del cromosoma x y se mantiene la represión transcripcional perfiles¹³. A través del reconocimiento de secuencias de ADN CpG metilados de hemi, DNMT1 mantiene establecidos patrones de metilación por novo de metilación por ejemplo, represión de largo entremezclado Nuclear elemento 1 (línea 1) retrotransposón promotores para inhibir su propagación potencialmente carcinogénicos¹⁴. Pesar de poseer afinidad de Unión preferencial de ADN metilado hemi, DNMT1 puede metilato unmethylated CpG secuencias de isla (CGI) en las células mutantes DNMT3a/b ^{– / –} , cumpliendo un papel de la metilación de novo de emergencia¹⁵ . Así debido a la naturaleza semi conservadora de ADN replicación¹⁶, metilación de mantenimiento puede recapitular fielmente firmas de metilación de los padres a la célula hija¹⁷.

Sin embargo, para gene expresión ser modificación de la metilación dinámicamente modulada, represivo debe borrarse, que puede lograrse mediante desmetilación pasiva y activa mecanismos¹⁸. Las proteínas de la translocasa (TET) de diez-once perteneciente a una familia conservada de proteínas dioxygenase son capaces de iterativo oxidación de grupos metilo en CpG residuos¹⁹. Estas proteínas de Tet, homólogas a proteínas de unión de J-Base (JBP) descubiertas en Tripanosoma bruceii, reconocen y atan la DNA modificada bases por ejemplo 5mC y oxigenar estos residuos 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5 – carboxylcytosine (5caC)²⁰. Proteína Tet facilitó oxidación de 5mC resultados en cambio de la conformación gradual de metilo a configuraciones hidroxilo, carbonilo y carboxilato, sin embargo modificaciones 5fC y 5caC pueden ser sintetizados de 5mC oxidación^{21, 22 , 23 , 24}.

Una indicación informativa de actividad de la proteína TET en la comprensión de su regulación es estudiar la distribución y abundancia de marcas oxi-metil-citosina. 5mC significativa presencia en CpG pobres promotores es detectable en contraste con las regiones ricas de unmethylated CpG, siendo ésta última característica de la GPC de islas²⁵. A través de los tejidos, más tejidos metilación específica se observa en el cerebro, testículo y sangre y mucosa oral exhiben mayor hipometilación, indicando un patrón de metilación diferencial en tejido promotores específicos²⁶.

A través de la utilización de anti-5mC sensible y anti-5hmC los anticuerpos en selectivo metilo/hidroximetil ADN inmunoprecipitación (meDIP/hmeDIP) y secuenciación de alto rendimiento posterior, Ficz et al. demostrados 5hmC alta ocupación en promotores, los exones o secuencias de retrotransposón LINE-1 que correlacionaron con los niveles de la 5mC reducida en esos lugares en ratón embrionario tallo las células²⁷. Inversamente, mayor enriquecimiento de 5mC observó en secuencias repetitivas satélite donde 5hmC presencia era limitada²⁸. Estudios realizados en tejido fino del cerebro lóbulo frontal humano revelan 5hmC altamente significativo enriquecimiento, cuatro veces mayor que en las células madre embrionarias de ratón²⁸. En concordancia con las observaciones anteriores, secuenciación de alto rendimiento del lóbulo frontal tejido ilustrado mayoría 55-59% de la señal de 5hmC localizada en baja densidad regiones promotoras de CpG, 35-38% dentro de los cuerpos gene y aproximadamente 6% de ocupación en intergénico regiones. En contraste, 5mC se enriqueció en regiones intergénicas (25-26%) y mayor en órganos de la gene (52-55%) pero menor (22-24%) en el promotor secuencias²⁹. Estos estudios indican la abundancia de 5hmC en células madre embrionarias y tejido somático, particularmente el cerebro, sin embargo, las investigaciones sobre las distribuciones 5caC y fC 5 son limitadas.

Curiosamente, recientemente descubierto en eucariotas, la metilación de residuos de adenina en el nitrógeno de la posición 6 (N⁶) exhibición (6mA) una abundancia genómica perfil inverso al de 5mC³⁰. Observaciones de cromatografía líquida acoplada espectrometría total en tándem revelan niveles absolutos de 6mA para existir en exceso en el pez cebra y embriones tempranos porcinos comparados con esperma con sus niveles (0.003% de genomic adenines) aumentando constantemente sobre fertilización, un pico en la etapa de desarrollo de mórula (33 veces más alta que la esperma) y llegando a niveles somáticos de estado estacionario de 0.004% de genomic adenines³¹. Inmunoprecipitación 6mA enriquecido de secuencias de ADN ha demostrado ocupación predominante (aproximadamente 80% enriquecimiento) de esta marca en el elemento repetitivo regiones y sitios de inicio transcripcional³². Estas observaciones contextualizar y validar el descubrimiento de 6mA demetilasa nulo eel células exponiendo 6mA acumulada mediada por silenciamiento del retrotransposón LINE-1 comparado con elementos transcripcionalmente activos en células de tipo salvaje. Estos datos sugieren una función reguladora transcripcional 6mA³³.

Mientras que conjugados etiquetas bioquímicos juntados a ensayos de inmersión posterior indican presencia o ausencia de derivados oxidados METILCITOSINA (oxi-mCs), no puede impartir información cuantificable de estas marcas^34, o distribución espacial ³⁵. un protocolo sensible detección inmunoquímica de 5hmC y 5caC fue recientemente desarrollado³⁶. Este método de immunostaining basados en anticuerpos secundarios conjugado fluoróforo juntada con utilizando microscopía confocal láser posee la ventaja de proporcionar la localización visual de estas modificaciones del ADN dentro de las células, por lo tanto, destacando individual positiva o negativamente manchadas células correspondientes con la heterogénea presencia de las marcas. Las intensidades de señal absoluta 5hmC y 5caC como amplificados por los anticuerpos conjugados permiten interpretaciones semi-cuantitativo que se propongan sobre la magnitud y las posiciones de estas marcas dentro del núcleo por ejemplo regiones heterochromatic y euchromatic ^{37 , 38}. aquí se describe una técnica para el análisis computacional de imágenes de microscopía confocal. La generación de la distribución espacial de 2,5 D parcelas para la visualización de distintas 5hmC y picos de la señal de 5caC por pixel y sus ubicaciones dentro de los núcleos se demuestra. Histograma de parcelas de 5hmC y 5caC perfiles de intensidad de señal pueden ilustrar las tendencias en la abundancia de estas marcas como los picos y canales son trazados como canales separados no superpuestos. Finalmente, mediante la implementación de la función de colocalización, puede determinarse el grado de proximidad de una señal a otro y como resultado de esto, pueden identificarse sus respectivas coordenadas genómicas.