DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

DNA metilasyonu, transkripsiyon yönetmelik ile ilişkili bir iyi belgelenmiş mekanizması gerektirir bir 5′-sitozin-fosfat-guanin-3 sitozin kalıntılarında modifikasyonu ‘ (KSY) dinükleotit bağlam metil grubu eklenmesi ile (-CH₃) 5- 5-metilsitozin (5mC)¹kurmaya sitozin pirimidin yüzük Karbon atomu. Memelilerde, CpGs yaklaşık % 70’i kendiliğinden deaminate 5mC mutajenik eğilimi timin²sayesinde bu palindromik sırası tükenmiş olarak sadece %1 onların genleri oluşturan metillenmiş. Gen organizatörü dizileri üzerinde metil gruplarının varlığı omurgalılar^3,4,5‘ te transkripsiyon baskı ile güçlü korelasyon göster. Bu metil grubu eklenmesi katalize son derece korunmuş DNA Metiltransferaz (DNMT) enzim DNMT3a, 3b ve 3 L ve sırasıyla KSY cytosines de novo ve bakım metilasyonu içeriklerde değişiklik DNMT1 tarafından⁶. DNMT3A/B ifade embriyonik kök hücreler ve epiblast geliştirme sırasında yüksek; Ancak azalan ifadesini pluripotent hücre lineage taahhüt somatik kader farklılaşma⁸sırasında takip görülmektedir. Bir işlevsel artıklık paylaşmak Iken, düzgün fare embriyo tespit 3a ama ağırlıklı olarak neuroectoderm ve koryonik ektoderm doku⁸için yerelleştirilmiş 3b ile doku özgü ifade desenleri, DNMT3a ve 3b görüntüler.

Metilasyon imzalar mitoz ve mayoz¹⁰sırasında devralınabilir. Bakım metilasyonu hemi metillenmiş palindromları çift iplikçikli DNA¹¹mevcut CpG sitozin kalıntılarının kolaylaştırdı DNMT1 değişiklik içerir. Sonuç olarak, genomik metilasyonu hücre döngüsü¹²S aşamasında en yüksek düzeyde ve DNMT1 bağlar DNA çoğaltma, Çatallar¹¹ . DNMT1 böylece yeni sentezlenmiş DNA iplikçikleri ayırt etme, x kromozomu inactivation teşvik ve transkripsiyon baskı profilleri¹³sürdürmek değiştirilmediğinden cytosines methylates. Hemi metillenmiş DNA CpG dizileri tanıma programını DNMT1 kurulan desen de novo metilasyonu örneğin baskı uzun serpiştirilmiş nükleer öğesi 1 (Satır1) sinirlari metilasyon korur. retrotransposon rehberleri onun potansiyel kanserojen yayma¹⁴etkisizleştirmek için. DNA tercihli bağlama benzeşme Hemi metillenmiş sahip olsa da, DNMT1 bazlar CpG Adası (CGI) dizileri DNMT3a/b ^{– / –} mutant hücrelerdeki bir acil durum de novo metilasyonu rolünü^{15 uygun methylate} . Böylece DNA çoğaltma¹⁶yarı muhafazakar doğası nedeniyle, bakım metilasyonu sadakatle kızı hücre¹⁷üst öğesinden metilasyonu imzalar özetlemek.

Ancak, gen için dinamik olarak ayarlanmış, baskıcı metilasyonu değişiklik olması ifade, hangi pasif ve aktif demethylation mekanizmaları¹⁸tarafından elde edilebilir silinmesi gerekir. Korunmuş dioxygenase proteinlerin ailesine ait on-Eleven translokaz (TET) proteinler CpG artıkları¹⁹metil gruplarının yinelemeli oksidasyon yeteneğine sahiptirler. Bu Tet proteinler, J-temel proteinler Trypanosome bruceiiiçinde keşfetti (JBP) için homolog tanımak ve değiştirilmiş DNA bind örneğin 5mC üsleri ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5 – bu kalıntıları oksijen carboxylcytosine (5caC)²⁰. Ancak 5 fC ve 5caC değişiklikleri doğrudan 5mC oksidasyon^21, sentez Tet protein oksidasyon kademeli conformation değişikliğinden metil yapılandırmaları, hidroksil, karbonil ve karboksilat 5mC sonuçlarının kolaylaştırdı ^{22 , 23 , 24}.

TET protein etkinliği onların yönetmelik anlamada bilgilendirici belirtisi dağıtım ve bereket oksi-metil-sitozin işaretlerinin okuyor. KSY zavallı rehberleri önemli 5mC varlığı aksine bazlar CpG zengin bölgeleri tespit, ikinci varlık CpG karakteristik²⁵Adaları. Dokular arasında oral mukoza sergi iken en büyük hypomethylation, beyin, testis ve kan belirli metilasyonu görülmektedir en yüksek doku doku belirli rehberleri²⁶, meydana gelen bir değişiklik metilasyonu desen gösteren.

Duyarlı anti-5mC ve anti-5hmC kullanarak aracılığıyla antikorlar seçici metil/hydroxymethyl DNA’sı immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP) ve sonraki yüksek işlem hacmi sıralama, Ficz vd. , yüksek 5hmC doluluk rehberleri, gösterdi, kök hücreleri²⁷ekzonlar ve düşük 5mC seviyeleri, bu yerlerdeki fare embriyonik ile ilişkili hat-1 retrotransposon dizileri. Ters, en büyük 5mC zenginleştirme 5hmC varlığı sınırlı²⁸neredeydi tekrarlayan uydu dizileri görülmüştür. İnsan ön lobunda beyin dokusu üzerinde gerçekleştirilen çalışmalar son derece önemli 5hmC zenginleştirme, dört kat daha yüksek fare embriyonik kök hücre²⁸ortaya koyuyor. Önceki gözlemleri ile uyum içinde yüksek işlem hacmi sıralama frontal lob resimli doku çoğunluğu 55-%59 5hmC sinyal CpG organizatörü bölgeler, gen organları ve yaklaşık % 6 doluluk intergenic, % 35-38’lik düşük yoğunluklu yerelleştirilmiş bölgeler. Buna ek olarak, 5mC intergenic bölgeler (% 25-26) ve daha yüksek gen organları (52-%55) içinde zenginleştirilmiş ama organizatörü, azaltılmış (22-%24)²⁹dizileri. 5 fC ve 5caC dağıtımları üzerine araştırmalar sınırlıdır ancak bu çalışmalar embriyonik kök hücreler ve somatik doku, özellikle beyin, 5hmC zenginliği gösteriyor.

İlginçtir ki, son zamanlarda Ökaryotlar, metilasyon pozisyon 6 azot (N⁶), adenin kalıntılarının keşfetti (6mA) ekran genomik bereket profil ters 5mC³⁰. Sıvı Kromatografi birleştiğinde tandem kütle spektrometresi gözlemler ortaya 6mA mutlak düzeyleri fazla zebra balığı ve domuz erken embriyolar sperm onun düzeyleri (% 0,003 genomik adenines) ile karşılaştırıldığında var döllenme giderek artan morula gelişimsel sahne (33 kat sperm yüksek) girmeyi başaran ve %0,004 genomik adenines³¹somatik düzeyde kararlı duruma ulaştı. Immunoprecipitation zenginleştirilmiş 6mA DNA dizilerinin baskın doluluk (yaklaşık % 80’i Zenginleştirme) bu işareti yinelenen öğe bölgeleri ve transkripsiyon başlangıç siteleri³²olarak göstermiştir. Bu gözlemler contextualize ve 6mA demethylase boş e keşfi doğrulamakmbryonic kök hücre birikmiş 6mA sergilenmesi hat-1 retrotransposon susturmak wildtype hücrelerdeki transcriptionally etkin öğelere göre aracılık. Bu veriler bir transkripsiyon düzenleyici fonksiyonu 6mA³³için öneririz.

Varlığı ya da yokluğu oksitlenmiş metilsitozin türevleri (oksi-mCs) sonraki DIP deneyleri için birleştiğinde konjuge biyokimyasal etiketleri gösterir iken onlar kayma dağıtım veya bu işaretleri^34, ölçülebilir bilgi vermek olamaz ³⁵. son zamanlarda gelişmiş³⁶5hmC ve 5caC hassas immunochemical tespiti için bir protokol yapıldı. Tarama lazer confocal mikroskobu kullanan ile birleştiğinde bu Birleşik fluorophore ikincil immunostaining antikor tabanlı yöntem böylece hücrelerin içindeki bu DNA değişiklikleri görsel yerelleştirme sağlayan benzersiz avantajı sahip olur, bireysel vurgulayan olumlu veya olumsuz yönde bu işaretleri türdeş olmayan varlığı ile karşılık gelen hücreler lekeli. 5hmC ve 5caC mutlak sinyal yoğunluklarını konjuge antikorlar tarafından güçlendirilmiş pozisyonları bu izlerini çekirdek içinde ve büyüklüğü hakkında örneğin heterochromatic ve euchromatic bölgelerinde önerilecek yarı kantitatif Yorumları etkinleştirmek ^{37 , 38}. burada bir teknik confocal mikroskobu görüntüleri Hesaplamalı analizi için kod sayfası kullanılmıştır. Farklı 5hmC görüntülemek için 2.5D kayma dağıtım nesil çizer ve 5caC sinyal doruklarına başına piksel ve konumlarına çekirdekleri içinde gösterdi. Çubuk grafik 5hmC araziler ve 5caC sinyal şiddeti profilleri bu işaretleri bolca tepeler olarak eğilimleri göstermek ve tekneler ayrı üst üste kanal olarak çizilir. Son olarak, colocalization işlevini uygulayarak, bir sinyal yakınlık derecesi belirlenebilir ve bunun sonucu olarak, onların anılan sıraya göre genomik koordinatları tespit edilebilir.