Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

DNA-Methylierung, ein gut dokumentierter Mechanismus verbunden mit transcriptional Regelung bringt Änderung von Cytosin-Rückständen in eine 5′-Cytosin-Phosphat-Guanin-3 “(CpG) Dinucleotide Kontext über die Zugabe einer Methylgruppe (-CH₃), 5 – Kohlenstoffatom der Cytosin Pyrimidine Ring 5-Methylcytosine (5mC)¹zu bilden. Bei Säugetieren sind etwa 70 % der Verbrauchsgüter methyliert, die nur 1 % von ihrem Genom darstellt, wie sie dieser palindromische Sequenz aufgrund 5mC mutagene Neigung zu deaminate spontan zu Thymin²aufgebraucht sind. Vorhandensein von Methylgruppen auf gen Promotorsequenzen zeigen starke Korrelation mit transcriptional Repression in Wirbeltieren^3,4,5. Zugabe von diese Methylgruppen ist katalysiert durch hoch konservierte DNA-Methyltransferase (DNMT) Enzyme DNMT3a, 3 b und 3 L und DNMT1 die CpG Cytosines in de Novo und Wartung Methylierung zusammenhängen bzw. ändern⁶. DNMT3A/B Ausdruck ist während der Entwicklung in embryonale Stammzellen und Epiblast erhöht; jedoch ist seine verminderte Expression nach pluripotente Zelle Abstammung Engagement für somatische Schicksale während der Differenzierung⁸beobachtet. Während funktionelle Redundanz zu teilen, display DNMT3a und 3 b gewebespezifischen Expressionsmuster mit 3a einheitlich in Mausembryonen erkannt aber 3 b überwiegend auf Neuroectoderm und Chorion Ektoderm Gewebe⁸lokalisiert.

Methylierung Signaturen können während der Mitose und Meiose¹⁰vererbt werden. Wartung-Methylierung beinhaltet DNMT1 erleichtert Änderung der CpG Cytosin Rückstände im Hemi methyliert Palindrome auf doppelsträngigen DNA-¹¹. DNMT1 bindet DNA bei Replikation Gabeln¹¹ und infolgedessen genomische Methylierung Ebenen Höhepunkt während der S-Phase des Zellzyklus¹². DNMT1 methylates unveränderten Cytosines dadurch neu synthetisierten DNA-Stränge zu unterscheiden, X-Chromosom Inaktivierung zu fördern und pflegen transkriptionellen Repression Profile¹³. Durch Anerkennung der Hemi-methylierte CpG DNA-Sequenzen unterhält DNMT1 etablierte Muster der Methylierung abgegrenzt durch de Novo Methylierung z.B. Unterdrückung von langen durchsetzt Nuclear Element 1 (Linie1) Retrotransposon Promotoren, die potenziell krebserregend Vermehrung¹⁴zu hemmen. Obwohl Hemi-methylierte DNA bevorzugte Bindungsaffinität zu besitzen, können DNMT1 unmethylated CpG-Insel (CGI)-Sequenzen in DNMT3a/b ^{– / –} Mutantenzellen methylieren ein Notfall de Novo Methylierung Rolle¹⁵ . So kann aufgrund der semi-konservative Art der DNA-Replikation¹⁶Wartung Methylierung treu Methylierung Unterschriften von übergeordneten Tochterzelle¹⁷rekapitulieren.

Allerdings muss für gen Ausdruck dynamisch moduliert, repressiven Methylierung Modifikation ist gelöscht werden, lässt sich von passiven und aktiven Demethylierung Mechanismen¹⁸. Die zehn-elf Translocase (TET) Proteine aus einer erhaltenen Familie Dioxygenase Proteine sind in der Lage der iterativen Oxidation von Methylgruppen auf CpG Rückstände¹⁹. Diese Tet Proteine, homolog zu J-Base-bindende Proteine (JBP) entdeckt in Trypanosomen Bruceii, erkennen und binden veränderte DNA Basen z.B. 5mC und diese Rückstände, 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5 – Sauerstoff Carboxylcytosine (5caC)²⁰. Tet-Protein erleichtert Oxidation von 5mC führt schrittweise Konformation Wechsel von Methyl, Hydroxyl, Carbonyl und Carboxylat Konfigurationen, aber 5fC und 5caC Änderungen direkt aus 5mC Oxidation^21, synthetisiert werden können ^{22 , 23 , 24}.

Informative Angabe der TET Proteinaktivität verstehen ihre Regulierung studiert die Verteilung und die Fülle der Oxi-Methyl-Cytosin-Marken. Erhebliche 5mC Präsenz auf CpG Armen Promotoren ist im Gegensatz zu unmethylated CpG reichen Regionen nachweisbar, letztere Merkmal der CpG Inseln²⁵. Über Gewebe, höchste Gewebe, die spezifische Methylierung in Blut, Gehirn und Hoden beobachtet wird, während der Mundschleimhaut zeigen größte Hypomethylierung zeigt eine differenzielle Methylierung Muster an Gewebe spezifische Promotoren²⁶auftretenden.

Durch Nutzung der sensiblen Anti-5mC und Anti-5hmC demonstriert Antikörper im selektiven Methyl/Hydroxymethyl DNA Immunopräzipitation (MeDIP/HmeDIP) und anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung, Ficz Et Al. hohe 5hmC Belegung an Projektträger, Exons und LINE-1 Retrotransposon Sequenzen die korreliert mit reduzierten 5mC Ebenen an diesen Standorten im embryonalen Maus Stammzellen Zellen²⁷. Umgekehrt beobachtet wo war 5hmC Anwesenheit begrenzt²⁸größten 5mC Bereicherung bei sich wiederholenden Sat-Sequenzen. Studien an menschlichen Frontallappen Hirngewebe zeigen hochsignifikante 5hmC Bereicherung, Vierfache höher als bei Maus embryonale Stammzellen²⁸. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen lokalisiert Hochdurchsatz-Sequenzierung der Frontallappen Gewebe illustriert Mehrheit 55-59 % des 5hmC-Signals bei geringer Dichte CpG Förderer Regionen, 35-38 % innerhalb von gen stellen und ca. 6 % Auslastung bei intergenetischer Regionen. Im Gegensatz dazu 5mC war bei intergenetischer Regionen (25-26 %) und höher in gen Gremien (52-55 %) bereichert, sondern reduzierte (22-24 %) beim Projektträger Sequenzen²⁹. Diese Studien zeigen Fülle von 5hmC in embryonalen Stammzellen und somatischen Gewebe, insbesondere das Gehirn, aber Untersuchungen auf 5fC und 5caC Distributionen begrenzt sind.

Interessant ist, vor kurzem entdeckt in den Eukaryotes, Methylierung von Adenin Rückstände auf der Position 6 Stickstoff (N-⁶) (6mA) Display eine genomische Fülle Profil invers zu derjenigen 5mC³⁰. Beobachtungen von Flüssigkeitschromatographie gekoppelt-Tandem-Massenspektrometrie zeigen 6mA absoluten Niveaus im Übermaß im Zebrafisch und Schweinen frühen Embryo im Vergleich zu den Samenzellen mit seinen Ebenen (0,003 % der genomischen Adenines) bestehen bei der Befruchtung, stetig Höchststand von Morula Entwicklungsstadium (33 Fach höher als Spermien) und somatische Ausmaße Steady-State von 0,004 % der genomischen Adenines³¹. Immunopräzipitation 6mA bereichert DNA-Sequenzen hat vorherrschende Belegung (ca. 80 % Anreicherung) von dieser Marke auf sich wiederholende Element Regionen und transkriptionelle Start Seiten³²gezeigt. Diese Beobachtungen zu kontextualisieren und validieren die Entdeckung der 6mA Demethylase-Null eMbryonic Stammzellen ausstellenden angesammelten 6mA vermittelt transcriptionally aktiven Elemente in Wildtyp-Zellen gegenüber LINE-1 Retrotransposon zum Schweigen zu bringen. Diese Daten schlagen eine transcriptional regulierende Funktion für 6mA³³.

Während konjugierten Biochemische Tags gekoppelt an nachfolgende DIP-Assays Vorhandensein oder Fehlen von oxidierten Methylcytosine Derivate (Oxi-mCs) angeben, können nicht sie räumliche Verteilung oder quantifizierbare Informationen von diesen Marken^34, vermitteln. ³⁵. ein Protokoll für sensible immunchemische Nachweis von 5hmC und 5caC wurde vor kurzem entwickelten³⁶. Diese Fluorophor konjugiert sekundäre Antikörper-basierten Immunostaining Methode gepaart mit Verwendung von Scan konfokale Lasermikroskopie besitzt den einzigartigen Vorteil, dass visuelle Lokalisierung dieser DNA-Modifikationen innerhalb der Zellen, so, Betonung einzelner positiv oder negativ gefärbt Zellen entsprechend der heterogenen Präsenz dieser Marken. Die 5hmC und 5caC absolute Signalintensitäten aktivieren, da durch die konjugierten Antikörper verstärkt semi-quantitative Interpretationen über das Ausmaß und die Positionen dieser Marken innerhalb des Zellkerns z.B. heterochromatischen und euchromatisch Regionen vorgeschlagen werden ^{37 , 38}. hier eine Technik für die computergestützte Analyse der konfokalen Mikroskopie-Bildern beschrieben. Die Generation der räumlichen Verteilung 2.5D Grundstücke für die Anzeige von verschiedenen 5hmC und 5caC Signalspitzen pro Pixel und deren Standorte innerhalb Kerne zeigt. Histogramm Grundstücke von 5hmC und 5caC Signal Intensität Profile zeigen Trends in Hülle und Fülle dieser Marken als die Gipfel und Tröge sind als separate nicht überlappende Kanäle dargestellt. Schließlich durch die Implementierung der Kolokalisierung-Funktion, der Grad der Nähe eines Signals ermittelt werden und als Folge davon, ihre jeweiligen genomischen Koordinaten identifiziert werden können.