Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal
Summary
Recentemente scoperto forme ossidate di 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) può rappresentare distinte modificazioni del DNA con ruoli funzionali unici. Qui è descritto un flusso di lavoro semi-quantitativa per visualizzazione della distribuzione spaziale di oxi-mCs’, profilatura di intensità di segnale e colocalizzazione.
Abstract
Per diversi decenni, la 5-metilcitosina (5mC) è stato pensato per essere l’unica modifica di DNA con un significato funzionale nei metazoi. La scoperta di ossidazione enzimatica di 5mC 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC), come pure la rilevazione di N6-methyladenine (6mA) nel DNA degli organismi multicellulari ha fornito ulteriori gradi di complessità della ricerca epigenetica. Secondo un crescente corpo di evidenze sperimentali, queste modificazioni del DNA romanzo possono svolgere ruoli specifici in diversi processi cellulari e dello sviluppo. D’importanza, come alcuni di questi marchi (e. g. 5hmC, 5fC e 5caC) esposizione del tessuto – e inerente allo sviluppo stadio-specifico avvenimento nei vertebrati, immunochimica rappresenta un importante strumento che permette la valutazione della distribuzione spaziale delle modificazioni del DNA in diversi contesti biologici. Qui sono descritti i metodi per l’analisi computazionale di modificazioni del DNA visualizzati immunostaining seguita da microscopia confocal. In particolare, la generazione della dimensione 2,5 (2,5 D) trame di intensità del segnale, segnale intensità profili, quantificazione dell’intensità in più celle e determinazione dei coefficienti di colocalizzazione di segnale di colorazione sono mostrati. Collettivamente, queste tecniche possono essere operative nel valutare i livelli e la localizzazione di queste modificazioni del DNA nel nucleo, contribuire a delucidare i loro ruoli biologici nei metazoi.
Introduction
Metilazione del DNA, un meccanismo ben documentato connesso con regolazione trascrizionale comporta la modifica dei residui della citosina in un 5′-citosina-fosfato-guanina-3′ contesto dinucleotide (CpG) tramite l’aggiunta di un gruppo metilico (-CH3) per la 5 – atomo di carbonio dell’anello pirimidinico citosina per formare la 5-metilcitosina (5mC)1. Nei mammiferi, circa il 70% di CpGs sono metilati che costituisce solo l’1% del loro genoma come loro sono esauriti di questa sequenza palindromica a causa di 5mC mutagene propensione a spontaneamente ossidativamente a timina2. Presenza di gruppi metilici su sequenze del promotore di geni mostrano forte correlazione con la repressione trascrizionale in vertebrati3,4,5. Aggiunta di questi gruppi metilici è catalizzata da enzimi di metiltransferasi (DNMT) DNMT3a DNA altamente conservata, 3b e 3 L e DNMT1 che modificano rispettivamente CpG cytosines in contesti di metilazione de novo e manutenzione6. Espressione di DNMT3a/B è elevato durante lo sviluppo in cellule staminali embrionali ed epiblasto; Tuttavia sua diminuita espressione viene osservato a seguito di pluripotent cella lignaggio impegno a destini somatici durante la differenziazione8. Pur condividendo la ridondanza funzionale, DNMT3a e 3b visualizzare i modelli di espressione tessuto-specifica, con 3a rilevato uniformemente in embrioni di topo ma 3b prevalentemente localizzato a neuroectoderma ed ectoderma corionica tessuti8.
Firme di metilazione possono essere ereditate durante la mitosi e meiosi10. Metilazione di manutenzione coinvolge DNMT1 facilitato modifica dei residui di citosina CpG esistenti in hemi-metilato palindromi su double-stranded DNA11. DNMT1 lega DNA replica forcelle11 e metilazione genomica di conseguenza, i livelli di picco durante la fase S del ciclo cellulare12. DNMT1 metila non modificato cytosines favorendo così distinguere filamenti di DNA di nuova sintesi, inattivazione del cromosoma x e mantenimento di repressione trascrizionale profili13. Attraverso il riconoscimento di sequenze di DNA CpG hemi-metilato, DNMT1 mantiene modelli stabiliti di metilazione delimitate dalla repressione di de novo per esempio metilazione sparpagliato lungo nucleare elemento 1 (LINE1) retrotrasposone promotori per inibire la sua propagazione potenzialmente cancerogene14. Anche se in possesso di affinità di legame preferenziale del DNA metilato hemi, DNMT1 può metilare unmethylated CpG sequenze di isola (CGI) in cellule mutanti DNMT3a/b – / – , che soddisfano un ruolo di metilazione di emergenza de novo 15 . Così a causa della natura semi-conservatore di DNA replica16, metilazione di manutenzione può ricapitolare fedelmente e firme di metilazione da padre a figlia cella17.
Tuttavia, per gene espressione per essere modulato in modo dinamico, repressivo metilazione modifica dovrà essere cancellati, che può essere raggiunto da demetilazione passiva e attiva meccanismi18. Le proteine di Translocase (TET) dieci-undici appartenente ad una famiglia conservata di diossigenasi proteine sono in grado di ossidazione iterativo di gruppi metilici su CpG residui19. Queste proteine di Tet, omologhe proteine leganti la J-Base (JBP) scoperto nel Tripanosoma bruceii, riconoscere e legarsi DNA modificato basi per esempio 5mC e ossigenare questi residui 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) e 5 – carboxylcytosine (5caC)20. Proteina Tet ha facilitato l’ossidazione di 5mC risultati nel cambiamento di conformazione graduale da metil alle configurazioni dell’idrossile, carbonilico e carbossilato, tuttavia 5fC e 5caC le modifiche possono essere sintetizzate direttamente da 5mC ossidazione21, 22 , 23 , 24.
Un’indicazione ben informativa dell’attività della proteina TET a comprendere la loro regolazione è studiare la distribuzione e l’abbondanza di segni di oxi-metil-citosina. 5mC significativa presenza al CpG poveri promotori è rilevabile in contrasto con unmethylated CpG ricche regioni, l’ultimo che è caratteristico di CpG isole25. Attraverso tessuti, più alto tessuto specifica metilazione è osservata nel cervello, testicolo e sangue mentre mucosa orale esibiscono più grande ipometilazione, che indica un modello differenziale di metilazione che si verificano in tessuti specifici promotori26.
Utilizzando anti-5mC sensibili e anti-5hmC anticorpi in selettiva metile/idrossimetil DNA immunoprecipitazione (meDIP/hmeDIP) e successivo sequenziamento ad alta, eraldi et al hanno dimostrato 5hmC alta occupazione presso promotori, esoni e linea-1 retrotrasposone sequenze che correlato con i livelli di 5mC ridotta a queste posizioni nel topo embrionale staminali cellule27. Inversamente, più grande 5mC arricchimento è stata osservata alle sequenze ripetitive satellite dove 5hmC presenza era limitata28. Studi effettuati sul tessuto cerebrale umano del lobo frontale rivelano 5hmC altamente significativo arricchimento, quattro volte superiore in cellule staminali embrionali di topo28. In concordanza con le osservazioni precedenti, sequenziamento ad alta del lobo frontale tessuto illustrato maggioranza 55-59% di 5hmC segnale localizzato a bassa densità regioni promotrici di CpG, 35-38% all’interno di corpi di gene e circa il 6% occupazione presso intergenica regioni. Al contrario, 5mC è stata arricchita alle regioni intergeniche (25-26%) e più in alto all’interno dei corpi di gene (52-55%) ma ridotto (22-24%) al promotore sequenze29. Questi studi indicano abbondanza di 5hmC in cellule staminali embrionali e somatico tessuto, specialmente il cervello, tuttavia le indagini sulle distribuzioni fC 5 e 5caC sono limitate.
Interessante, recentemente scoperto negli eucarioti, la metilazione dei residui di adenina all’azoto (N6) posizione 6 (6mA) Visualizza un’abbondanza di genomic profile inverso a quello di 5mC30. Osservazioni da spettrometria di massa tandem di cromatografia liquida accoppiata rivelano 6mA livelli assoluti di esistere in eccesso nel pesce zebra e porcini embrioni in anticipo rispetto allo sperma con i suoi livelli (0,003% di genomiche adenine) al momento della fecondazione, in costante aumento raggiungendo lo stadio di sviluppo di morula (33 piega superiore dello sperma) e raggiungendo somatico livelli allo stato stazionario di 0,004% di genomica adenine31. Immunoprecipitazione di sequenze di DNA 6mA arricchito ha dimostrato occupazione predominante (circa 80% di arricchimento) di questo marchio a regioni elemento ripetitivo e inizio trascrizionale siti32. Queste osservazioni contestualizzare e convalidare la scoperta di 6mA demetilasi null ecellule staminali mbryonic espositrici accumulato 6mA mediata linea-1 retrotrasposone silenziamento rispetto agli elementi trascrizionalmente attivi in cellule wildtype. Questi dati suggeriscono una funzione regolatrice trascrizionale per 6mA33.
Mentre coniugati Tag biochimico accoppiato al successivo tuffo saggi indicare presenza o assenza di derivati ossidati metilcitosina (oxi-mCs), essi non possono impartire distribuzione spaziale o quantificabili informazioni di questi marchi34, 35. un protocollo per rilevazione immunochimica sensibile di 5hmC e 5caC è stata sviluppata di recente36. Questo metodo di immunostaining basato su anticorpo secondario fluoroforo coniugato accoppiato con l’utilizzo di microscopia confocale a scansione laser possiede il vantaggio unico di fornire la localizzazione visiva di queste modificazioni del DNA all’interno delle cellule, così, enfatizzando singoli positivamente o negativamente macchiato celle corrispondenti con la presenza eterogenea di questi segni. Le intensità di segnale assoluto 5hmC e 5caC come amplificato dagli anticorpi coniugati abilitare semiquantitative interpretazioni proposte circa la grandezza e le posizioni di questi segni all’interno del nucleo ad esempio regioni heterochromatic ed euchromatic 37 , 38. qui viene descritta una tecnica per l’analisi computazionale delle immagini di microscopia confocale. La generazione di distribuzione spaziale 2,5 D grafici per la visualizzazione di 5hmC distinti e picchi di segnale 5caC per pixel e loro posizioni all’interno dei nuclei è dimostrato. Istogramma appezzamenti di 5hmC e i profili di intensità di segnale 5caC possono illustrare le tendenze in abbondanza di questi segni come i picchi e depressioni vengono tracciate come canali non sovrapposti separati. Infine, implementando la funzione di colocalizzazione, può essere determinato il grado di vicinanza di un segnale a altro e di conseguenza, le loro rispettive coordinate genomiche possono essere identificati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive il graduale processo di generazione di rappresentazioni visive delle modificazioni del DNA all’interno dei nuclei. Mentre sensibili e di grande impatto, queste tecniche possiedono una serie di limitazioni.
È necessario sottolineare che i dati generati da 2,5 D trame, i profili di intensità del segnale e l’analisi di colocalizzazione sono semi-quantitativi in natura. A causa dell’illuminazione del punto per punto del campione durante l’acquisizione di immagini sul microscopio confocale a scansione laser, intensità del segnale assoluto di ogni canale vengono registrate. Tuttavia, questi non sono grandezze assoluto di 5hmC e 5caC essere rilevati e solo rappresentano indicazioni di presenza, assenza o scala di questi segni epigenetici.
Dovuto la natura ripetitiva di amplificazioni del segnale, limitazioni coerente con la grandezza delle macchine utilizzate per incrementare il segnale inevitabilmente confondono approssimazioni di vera occupazione genomico fisico di questi marchi34. La vera localizzazione genomica di questi segni può essere oscurata da queste proteine ingombranti, che fisicamente occupano aree non risolvibili anche ai limiti di risoluzione ottimale confocal di 200-300 nm34. Inoltre, l’intensità del segnale dei canali individuali per ogni marchio non può essere paragonata a vicenda a causa delle differenze nella sensibilità dell’anticorpo e fluoroforo coniugazione34. Tuttavia le informazioni ottenute con formazione immagine mette in luce l’organizzazione spaziale e temporale dei marchi genomici.
Per la quantificazione accurata dei segnali 5hmC e 5caC, nuclei sono evidenziati e piena contro il colorante di contrasto DAPI, chiaramente che delimitano la regione da analizzare. Questa procedura elimina il requisito per la calibrazione delle soglie Gate come rumore di fondo viene ignorata tramite il processo manuale di selezione nuclei1. Un’automazione di questo processo può essere realizzata nell’ultimo software che consente la segmentazione nucleare deve essere eseguita. Mentre pacchetti di software libero alternativo come FIJI sono disponibili per l’analisi di colocalizzazione, svantaggi, come l’obbligo di convertire immagini in formati binario a 8 bit, mascheramento delle immagini e l’immissione di dati di esclusione di formato per selezionare le regioni di interesse limite del accessibilità degli utenti di questo programma. Inoltre, considerando che il totale limitati livelli di 5hmC e 5caC nel genoma accoppiato con la loro posizione predominante alle regioni eucromatiche e, lo svuotamento delle sequenze genomic di CpG in generale, che circondano manuale dei nuclei introduce utente-bias. Di conseguenza, l’evidenziazione dei nuclei automaticamente presuppone che tutti gli eventi che si verificano all’interno della regione delimitata ad essere positivo e ignora eventuali pixel di sfondo che possono essere presenti. Così, l’analisi di immagini basati su pixel intensità può essere più significativo. Questi fattori sono importanti quando si considera l’uso del coefficiente di colocalizzazione di Mander per analizzare il grado di sovrapposizione spaziale tra due segnali, indipendentemente dalla loro intensità di segnale come opporsi al coefficiente di correlazione di Pearson, che presuppone un relazione lineare tra segnali.
Nel complesso, le tecniche descritte qui portano il tema della rappresentazione visiva di dati biologici in un formato intuitivo. Mentre l’analisi semi-quantitativa delle immagini non sostituiscono potenti tecniche come la spettrometria di massa in termini di sensibilità o risoluzione base unico genoma ampio sequencing, fornisce dati complementari permettendo inferenze ed ipotesi di essere concepito dall’analisi delle immagini con precisione.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato supportato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council [BB/N005759/1 a A.R.]. NRFH è stato finanziato dal The boschi Trust and The Stoneygate Trust [A1130 / M546]. Il microscopio Zeiss Elyra PS.1, l’elaborazione computer e software sono stati finanziati dalla BBSRC BB/L013827/1 (multidisciplinare Super risoluzione microscopia Facility presso grant Nottingham University)
Materials
| Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
| Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
| Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA |
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