Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

Methylation van DNA, een goed gedocumenteerde mechanisme geassocieerd met een transcriptionele verordening leidt tot wijziging van cytosine residuen in een 5′-cytosine-fosfaat-guanine-3′ (CpG) dinucleotide verband via de toevoeging van een methylgroep (-CH₃) aan op de 5 – koolstofatoom van de cytosine pyrimidine ring te vormen 5-methylcytosine (5mC)¹. Bij zoogdieren, zijn ongeveer 70% van de CpGs die slechts 1% van hun genoom vormt, aangezien zij zijn uitgeput van deze palindromische sequentie als gevolg van 5mC mutagene neiging om spontaan deaminate aan thymine²gemethyleerd. Aanwezigheid van de methylgroepen op gensequenties promotor weergeven sterke correlatie met transcriptionele repressie in gewervelde dieren^3,4,5. Toevoeging van deze methylgroepen wordt gekatalyseerd door zeer geconserveerde DNA methyltransferase (DNMT) enzymen DNMT3a 3b en 3 L en DNMT1 die respectievelijk wijzigen van apr cytosines in DOVO en onderhoud methylering contexten⁶. DNMT3A/B expressie is verhoogd tijdens de ontwikkeling in embryonale stamcellen en epiblast; echter zijn verminderde expressie wordt waargenomen na pluripotente cel lineage inzet voor somatische lot tijdens differentiatie⁸. Terwijl het delen van functionele redundantie, display DNMT3a en 3b weefsel-specifieke expressiepatronen, met 3a gedetecteerd gelijkmatig in muis embryo’s maar 3b voornamelijk gelokaliseerd op neuroectoderm en chorionic ectoderm weefsels⁸.

Methylation handtekeningen kunnen worden overgenomen tijdens de mitose en meiose¹⁰. Methylation van onderhoud omvat DNMT1 vergemakkelijkt wijziging van CpG cytosine residuen bestaande in hemi-gemethyleerd Palindromen op double-stranded DNA¹¹. DNMT1 bindt DNA replicatie vorken¹¹ en bijgevolg genomic methylering piek tijdens de S-fase van de celcyclus¹²niveaus. DNMT1 methyleert ongewijzigde cytosines daardoor onderscheiden van nieuw gesynthetiseerd DNA-strengen, bevordering van x-chromosoom inactivering en onderhouden van transcriptionele repressie profielen¹³. Door middel van erkenning van de hemi-gemethyleerd opeenvolgingen van DNA CpG houdt DNMT1 gevestigde patronen van methylering afgebakend door DOVO methylering bv onderdrukking van lange afgewisseld nucleaire Element 1 (lijn1) de initiatiefnemers van het retrotransposon voor de remming van haar potentieel kankerverwekkend propagatie¹⁴. Hoewel bezitten hemi-gemethyleerd DNA preferentiële bindende affiniteit, kunt DNMT1 unmethylated CpG eiland (CGI) sequenties in DNMT3a/b ^{– / –} mutantcellen, methylate vervullen een noodsituatie DOVO methylering rol¹⁵ . Dus als gevolg van de semi-conservatieve aard van DNA replicatie¹⁶, kan onderhoud methylering getrouw recapituleren methylering handtekeningen van bovenliggende dochtercel¹⁷.

Echter voor gen moet expressie als dynamisch gemoduleerde, repressieve methylering wijziging worden gewist, die kan worden bereikt door passieve en actieve demethylatie mechanismen¹⁸. De tien-elf Translocase (TET) eiwitten die behoren tot een geconserveerde familie van dioxygenase eiwitten zijn geschikt voor iteratieve oxidatie van methylgroepen op apr residuen¹⁹. Deze Tet eiwitten, homoloog aan J-Base bindende proteïnen (JBP) ontdekt in de bruceii van de trypanosoom, erkennen en binden van gemodificeerd DNA onderstellen van bijvoorbeeld 5mC en deze residuen 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-formylcytosine (5 fC) en 5 – zuurstof carboxylcytosine (5caC)²⁰. Tet eiwitten vergemakkelijkt oxidatie van 5mC leidt tot verandering van de stapsgewijze conformatie van methyl naar hydroxyl-, carbonyl- en carboxylaat-configuraties, maar 5fC en 5caC wijzigingen kunnen gesynthetiseerd worden rechtstreeks vanuit 5mC oxidatie^{21, 22 , 23 , 24}.

Informatieve indicatie van TET eiwitten activiteit inzicht in hun verordening bestudeert de distributie en de overvloed van oxi-methyl-cytosine merken. Belangrijke 5mC aanwezigheid op apr arme initiatiefnemers is aantoonbaar in tegenstelling tot de unmethylated apr rijke regio’s, de laatste is kenmerkend voor apr²⁵eilanden. Over weefsels, hoogste weefsel specifieke methylering wordt waargenomen in de hersenen, testis en bloed terwijl mondelinge mucosa vertonen grootste hypomethylation, geeft een patroon van de differentiële methylering plaatsvinden op weefsel specifieke initiatiefnemers²⁶.

Door gebruik te maken van gevoelige anti-5mC en anti-5hmC antilichamen in selectieve methyl/hydroxymethyl DNA immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP), en de daaropvolgende hoge doorvoer sequencing, Ficz et al. aangetoond hoog 5hmC bezetting op initiatiefnemers, exons en lijn-1 retrotransposon sequenties die gecorreleerd met verminderde 5mC niveaus op deze locaties in muis embryonale stengelgroenten cellen²⁷. Omgekeerd, werd grootste 5mC verrijking waargenomen op repetitieve satelliet sequenties waar 5hmC aanwezigheid was beperkt²⁸. Studies uitgevoerd op menselijke frontale kwab hersenweefsel onthullen veelbetekenend 5hmC verrijking, vier keer hoger dan in muis embryonale stamcellen²⁸. In overeenstemming met eerdere opmerkingen, hoge doorvoer sequentiebepaling van frontale kwab weefsel geïllustreerd meerderheid 55-59% van 5hmC signaal gelokaliseerd op lage dichtheid CpG promotor regio’s, 35-38% binnen gene organen en ongeveer 6% bezetting op intergenic regio’s. Daarentegen 5mC werd verrijkt bij intergenic regio’s (25-26%) en hoger in gen organen (52-55%) maar minder (22-24%) bij promotor²⁹sequenties. Deze studies tonen aan dat overvloed van 5hmC in embryonale stamcellen en somatische weefsel, vooral de hersenen, maar onderzoeken op 5fC en 5caC distributies beperkt zijn.

Interessant is dat onlangs ontdekt in eukaryoten, methylering van adenine residuen op de positie 6 stikstof (N-⁶) (6mA) display een genomic overvloed profile inverse aan die van 5mC³⁰. Observaties van de Spectrometrie van de massa van de tandem vloeistofchromatografie gekoppeld onthullen 6mA absolute niveaus bestaan in overmaat in zebravis en varkens vroege embryo’s in vergelijking met sperma met haar niveaus (0.003% van genomische adenines) gestaag op bevruchting, piek stadium de morula ontwikkelingsstoornissen (33 vouw hoger dan sperma) en het bereiken van de somatische niveaus steady-state 0.004% van genomische adenines³¹. Immunoprecipitation van DNA-sequenties 6mA verrijkt heeft aangetoond overheersende bezetting (ongeveer 80% verrijking) van dit merk op repetitieve element Regio’sen transcriptionele start sites³². Deze observaties contextualiseren en valideren van de ontdekking van 6mA demethylase-null ede cellen van de stam mbryonic exposeren geaccumuleerde 6mA gemedieerde lijn-1 retrotransposon tot zwijgen brengen t.o.v. transcriptionally actieve elementen in wildtype cellen. Deze gegevens stellen voor een transcriptionele regelgevingstaak voor 6mA³³.

Terwijl geconjugeerd biochemische labels gekoppeld aan latere DIP testen geven aan- of afwezigheid van geoxideerde methylcytosine derivaten (oxi-mCs), kunnen niet zij geven ruimtelijke verdeling of kwantificeerbare informatie van deze merken^{34, 35}. een protocol voor gevoelige immunochemical detectie van 5hmC en 5caC was onlangs ontwikkelde³⁶. Deze methode van geconjugeerd fluorophore secundair antilichaam gebaseerde immunokleuring gekoppeld met behulp van scanning laser confocal microscopie bezit het unieke voordeel dat visuele lokalisatie van deze DNA-wijzigingen binnen de cellen, dus nadruk op individuele positief dan wel negatief gekleurd cellen die overeenkomt met de heterogene aanwezigheid van deze merken. De 5hmC en 5caC absolute signaal intensiteit zoals versterkt door de geconjugeerde antilichamen in staat stellen semi-kwantitatieve interpretaties worden voorgesteld over de omvang en de standpunten van deze merken binnen de kern bijvoorbeeld hétérochromatique en euchromatique regio ‘s ^{37 , 38}. hier een techniek voor de computationele analyse van beelden van de confocal microscopie wordt beschreven. De generatie van 2.5D ruimtelijke verdeling percelen voor het weergeven van verschillende 5hmC en 5caC signaal pieken per pixel en hun locaties binnen kernen wordt gedemonstreerd. Histogram percelen van 5hmC en 5caC signaal intensiteit profielen kunnen illustreren trends in overvloed van deze merken als de toppen en troggen zijn uitgezet als afzonderlijke niet-overlappende kanalen. Tot slot, door de uitvoering van de colocalization-functie, de mate van de nabijheid van een signaal naar de andere kan worden bepaald en als gevolg hiervan, hun respectieve genomic coördinaten kunnen worden geïdentificeerd.