Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

Méthylation de l’ADN, un mécanisme bien documenté associé à la régulation transcriptionnelle entraîne la modification des résidus cytosine en 5′-cytosine-phosphate-guanine-3′ contexte dinucléotide (CpG) via l’addition d’un groupement méthyle (-CH₃) pour les 5 – atome de carbone du cycle pyrimidine cytosine pour former 5-méthylcytosine (5mC)¹. Chez les mammifères, environ 70 % des GPC sont méthylés qui constitue seulement 1 % de leurs génomes, selon qu’ils sont épuisés de cette séquence palindromique en raison de la propension mutagènes 5mC à désaminés spontanément à thymine². Présence de groupes méthyles sur les séquences de gène promoteur montrent la forte corrélation avec la répression transcriptionnelle dans vertébrés^3,4,5. Ajout de ces groupes méthyle est catalysée par hautement conservée ADN méthyltransférase (DNMT) enzymes DNMT3a, 3 b et 3 L et DNMT1 qui modifient les cytosines CpG dans des contextes de méthylation de novo et entretien respectivement⁶. Expression de Dnmt3a/B est élevée au cours du développement dans les cellules souches embryonnaires et l’épiblaste ; Cependant, son expression diminuée est observée suite pluripotentes cell lineage engagement aux destins somatiques au cours de la différenciation⁸. Tout en partageant la redondance fonctionnelle, DNMT3a et 3 b affichent les modes d’expression tissu-spécifique, avec 3 a détecté uniformément dans des embryons de souris, mais 3 b principalement localisé en neuroectoderme et ectoderme chorionique tissus⁸.

Signatures de méthylation peuvent être héritées au cours de la mitose et la méiose¹⁰. Méthylation de l’entretien implique la modification DNMT1 a facilité des résidus de cytosine CpG existant dans palindromes hemi-méthylées sur bicaténaire ADN¹¹. DNMT1 lie l’ADN en réplication fourchettes¹¹ et par conséquent, la méthylation génomique niveaux pic au cours de la phase S du cycle cellulaire¹²; DNMT1 méthyle cytosines non modifiés ainsi distinguer des brins d’ADN nouvellement synthétisés, promotion d’inactivation du chromosome x et le maintien de répression transcriptionnelle profils¹³. Par la reconnaissance de séquences d’ADN CpG hemi-méthylé, DNMT1 maintient des profils établis de méthylation délimités par novo de méthylation par exemple répression de Long 1 entrecoupées d’élément nucléaire (ligne1) rétrotransposon promoteurs pour empêcher sa propagation potentiellement cancérigène¹⁴. Bien que possédant l’affinité de liaison préférentielle ADN hémi-méthylé, DNMT1 peuvent méthyler des séquences de l’île (CGI) CpG non méthylés dans les cellules mutantes DNMT3a/b ^{– / –} , remplir un rôle de la méthylation d’urgence de novo ¹⁵ . Ainsi en raison de la nature semi conservatrice de la réplication de l’ADN¹⁶, méthylation de l’entretien peut récapituler fidèlement des signatures de méthylation du parent à la cellule fille¹⁷.

Toutefois, pour gene expression méthylation modulé dynamiquement, répressif modification doit être effacée, qui peut être réalisé par déméthylation passive et active des mécanismes¹⁸. Les protéines de Translocase (TET) de dix-onze appartenant à une famille conservée des protéines dioxygénase sont capables d’oxydation itérative des groupes méthyles sur CpG résidus¹⁹. Ces protéines Tet, homologues à des protéines de liaison de J-Base (JBP) découverts en bruceii Trypanosome, reconnaître et de lier l’ADN modifié par exemple 5mC des bases et oxygéner ces résidus 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5 – carboxylcytosine (5caC)²⁰. Protéines TET facilité oxydation des résultats 5mC dans changement de conformation progressive de méthyle aux configurations hydroxyle, carbonyle et carboxylate, mais des modifications 5FC et 5caC peuvent être synthétisées directement à partir de 5mC oxydation^{21, 22 , 23 , 24}.

Une indication informative de l’activité de protéines TET à comprendre leur régulation étudie la répartition et l’abondance des marques oxi-methyl-cytosine. 5mC importante présence au CpG pauvres promoteurs est détectable par contraste avec les régions riches de CpG non méthylées, ce dernier étant caractéristique du CpG des Iles²⁵. Dans l’ensemble de tissus, tissu plu spécifique méthylation est observée dans le cerveau, les testicules et les sang tandis que la muqueuse buccale pièce plus grande hypométhylation, indiquant un patron de méthylation différentielle se produisant à des tissus spécifiques promoteurs²⁶.

Par utilisant anti-5mC sensibles et anti-5hmC anticorps en sélectif de méthyle/hydroxyméthyl ADN immunoprécipitation (meDIP/hmeDIP) et le séquençage subséquent à haut débit, Ficz et coll. démontre 5hmC haute occupation aux promoteurs, exons et LINE-1 séquences des rétrotransposons qui corrélé avec le niveau de réduction 5mC à ces endroits en souris embryonnaire souches cellules²⁷. Inversement, plus grand enrichissement de 5mC a été observée à des séquences répétitives satellite où 5hmC présence était limitée²⁸. Études réalisées sur des tissus cérébraux humains lobe frontal révèlent l’enrichissement 5hmC hautement significative, quatre fois plus élevée que chez les cellules souches embryonnaires de souris²⁸. En concordance avec les observations précédentes, le séquençage à haut débit de lobe frontal tissus illustrés majorité 55 à 59 % du signal de 5hmC localisée à faible densité régions promotrices de CpG, 35 à 38 % au sein des organes de gène et environ 6 % d’occupation à intergénique régions. En revanche, 5mC s’est enrichi à régions intergéniques (25-26 %) et plus au sein des organes de gène (52-55 %), mais réduit (22-24 %) au promoteur séquences²⁹. Ces études indiquent l’abondance des 5hmC dans les cellules souches embryonnaires et somatiques tissulaires, en particulier le cerveau, mais les enquêtes sur les distributions 5FC et 5caC sont limitées.

Fait intéressant, récemment découvert chez les eucaryotes, la méthylation des résidus adénine à l’azote position 6 (N⁶) (6 ma) Visualisez une abondance génomique profil inverse à celle de 5mC³⁰. Observations de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse révèlent des niveaux absolus de 6mA d’exister en excès dans le poisson zèbre et porcines jeunes embryons par rapport au sperme avec ses niveaux (0,003 % des adénines génomiques) augmente régulièrement après la fécondation, atteignant le stade de développement de morula (33 fois plus élevée que les spermatozoïdes) et atteignant des niveaux de l’état stationnaire somatique de 0,004 % de génomique adénines³¹. Immunoprécipitation 6mA enrichi de séquences d’ADN a démontré occupation prédominante (environ 80 % d’enrichissement) de cette marque en régions élément répétitif et transcriptionnelle début sites³². Ces observations contextualisent et de valider la découverte de 6mA déméthylase null embryonic des cellules souches présentant 6mA accumulé médiée par LINE-1 rétrotransposon silencieux par rapport aux éléments transcriptionnellement actifs dans les cellules de type sauvage. Ces résultats suggèrent une fonction régulation transcriptionnelle pour 6mA³³.

Tandis que les balises biochimiques conjugués couplés aux déterminations ultérieures de DIP indiquent présence ou absence de dérivés oxydés méthylcytosine (oxi-mCs), qu’ils ne puissent communiquer distribution spatiale ou informations quantifiables de ces marques^{34, 35}. un protocole pour la sensibilité de détection immunochimique de 5hmC et de 5caC a été récemment mis au point³⁶. Cette méthode d’immunomarquage de base d’anticorps secondaire fluorophore conjugué couplée avec utilisant la microscopie confocale à balayage laser possède l’avantage unique de fournir une localisation visuelle de ces modifications de l’ADN dans les cellules, ainsi, mettant l’accent sur différents positivement ou négativement colorées cases correspondant à la présence hétérogène de ces marques. Les intensités de signal absolu 5hmC et 5caC comme amplifiée par l’anticorps conjugués aux semiquantitative interprétations à proposer sur l’ampleur et les positions de ces marques dans le noyau par exemple les régions hétérochromatiques et euchromatiques ^{37 , 38}. ici on décrit une technique pour l’analyse informatique des images de microscopie confocale. La génération de distribution spatiale 2,5 D parcelles pour l’affichage des 5hmC distincts et 5caC lueurs par pixel et leurs emplacements dans les noyaux est démontrée. Histogramme des parcelles de 5hmC et profils d’intensité signal 5caC peuvent illustrer des tendances dans l’abondance de ces marques comme les pics et creux est pointés comme des canaux séparés sans chevauchement. Enfin, en mettant en œuvre la fonction de colocalisation, le degré de proximité d’un signal à un autre peut être déterminé et en conséquence, leurs coordonnées respectives de génomiques peuvent être identifiées.