Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

מתילציה DNA, מנגנון מתועדת היטב המשויך תקנה תעתיק מצריכה שינוי של ציטוזין שאריות 5′-ציטוזין-פוספט-גואנין-3′ (CpG) ההקשר dinucleotide באמצעות הוספת קבוצת מתיל (-CH₃) 5- אטום פחמן של הטבעת פירימידין ציטוזין לטופס 5-methylcytosine (5mC)¹. אצל יונקים, כ- 70% של סחורות ארוזות לצרכן הם מפוגל המהווה 1% בלבד של הגנום שלהם כפי שהם דלה של רצף palindromic זה בשל נטיה מוטגניות 5mC כדי deaminate באופן ספונטני תימין². נוכחות של קבוצות מתיל ג’ין יזם ברצפי מראים מתאם חזק עם דיכוי גנים ברמת השעתוק חולייתנים^3,4,5. תוספת של קבוצות מתיל אלה הוא מזורז על ידי מאוד שנשמרת DNA אנזימים methyltransferase (DNMT) DNMT3a, 3b, 3 L DNMT1 המשנים את CpG cytosines בהקשרים מתילציה ותחזוקה של דה נובו בהתאמה⁶. הביטוי DNMT3A/B הוא גבוה במהלך התפתחות תאי גזע עובריים, epiblast; אולם הביטוי מופחתת שלה הוא ציין בעקבות pluripotent תא שושלת היוחסין מחויבות הגורלות סומאטית במהלך התמיינות⁸. תוך שיתוף יתירות פונקציונלית, DNMT3a ו- 3b להציג דפוסי ביטוי רקמות ספציפיות, עם 3a זוהה בצורה אחידה עוברי העכבר אבל 3b בעיקר מקומית neuroectoderm ו האאקטודרם שליה רקמות⁸.

יכול להיות תורשתית מתילציה חתימות במהלך מיטוזה, מיוזה¹⁰. מתילציה תחזוקה כוללת שינוי DNMT1 הקל של שאריות ציטוזין CpG הקיימים הפלינדרומים מפוגל חמי כפולה גדילי הדנ א¹¹. איגודים DNMT1 DNA-שכפול מזלגות¹¹ , כתוצאה מכך, מתילציה גנומית רמות שיא במהלך שלב S של מחזור התא¹². DNMT1 methylates cytosines שלא שונתה ובכך הבחנה גדילי DNA מסונתז לאחרונה, קידום שמושרש איון, שמירה על דיכוי גנים ברמת השעתוק פרופילים¹³. דרך זיהוי של רצפי DNA CpG מפוגל חמי, DNMT1 שומר על דפוסי הוקמה מתילציה התחום בין דה נובו מתילציה למשל הדיכוי של זמן וביניהם גרעיני רכיב 1 (LINE1) היזמים רטרוטרנספוזון כדי לעכב את הפצת קרצינוגני¹⁴. למרות בעלי זיקה מחייבת מועדף של ה-DNA מפוגל חמי, DNMT1 יכול methylate unmethylated איילנד (CGI) CpG רצפים בתאים DNMT3a/b ^{– / –} מוטציה, במילוי תפקיד מתילציה חירום דה נובו ¹⁵ . לפיכך בשל אופייה השמרני למחצה של שכפול הדנ א¹⁶, תחזוקה מתילציה יכול בנאמנות מסכם את הדברים חתימות מתילציה מהאב תא בת¹⁷.

עם זאת, עבור ג’ין הביטוי יהיה שינוי מתילציה מאופנן באופן דינמי, הדיכוי חייב להימחק, אשר יכולה להיות מושגת על ידי מנגנוני פסיביים ואקטיביים demethylation¹⁸. החלבונים Translocase (ט) 10-11 השייכים למשפחת dioxygenase חלבונים שנשמרת מסוגלים חמצון איטרטיביים של קבוצות מתיל-CpG שאריות¹⁹. חלבונים אלו ט, הומולוגי ל J-בסיס מחייב חלבונים (JBP) התגלו Trypanosome bruceii, מזהה ואיגוד ששונה DNA בסיסים כגון 5mC ו חמצן אלה שאריות 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC), 5 – carboxylcytosine (5caC)²⁰. ט חלבון הקל חמצון של 5mC תוצאות שינוי קונפורמציה stepwise ממתיל תצורות הידרוקסיל, קרבוניל, carboxylate, אולם שינויים 5fC ו 5caC יכול להיות מסונתז ישירות מ- 5mC חמצון^{21, 22 , 23 , 24}.

אינדיקציה מקיף ט פעילות החלבון בהבנת רגולציה שלהם הוא לומד את התפוצה והשפע של סימני oxi-מתיל-ציטוזין. נוכחות משמעותית 5mC היזמים המסכן CpG לזיהוי בניגוד unmethylated CpG אזורים עשירים, הישות השנייה האופייניים CpG איי²⁵. מעבר רקמות, רקמות הגבוהה מתילציה מסוימת הוא ציין המוח, testis ודם בזמן האוראלית התערוכה הגדולה ביותר hypomethylation, המציין תבנית מתילציה דיפרנציאלית המתרחשים בגיל מסוים היזמים רקמות²⁶.

באמצעות ניצול רגיש anti-5mC אנטי-5hmC נוגדנים במתיל סלקטיבית/hydroxymethyl דנ א immunoprecipitation (meDIP/hmeDIP), ורצף תפוקה גבוהה עוקבות, Ficz. et al. הפגינו תפוסה גבוהה 5hmC על היזמים, exons ורצפים רטרוטרנספוזון של קו-1 אשר בקורלציה עם רמות 5mC מופחת במקומות אלה עכבר עובריים גזע תאים²⁷. הפוך, העשרה 5mC הגדול ביותר נצפתה ב לווין חוזרות רצפים היכן נוכחות 5hmC היה מוגבל²⁸. מחקרים שבוצעו על רקמת המוח האנושי האונה המצחית לחשוף 5hmC משמעותית ביותר העשרה, גבוה יותר מאשר בתאי גזע עובריים בעכבר²⁸ארבע קיפול. אברו עם תצפיות הקודם, תפוקה גבוהה רצף של האונה הקדמית רקמות מאויר הרוב 55-59% 5hmC אות מקומי על צפיפות נמוכה CpG יזם אזורים, 35-38% בתוך הגן וגופי כ 6% תפוסה-intergenic אזורים. לעומת זאת, 5mC היה מועשר ב אזורים intergenic (25-26%) ומעלה בתוך הגן גופים (52-55%) אך מופחת (22-24%)-יזם רצף²⁹. מחקרים אלה מצביעים על שפע של 5hmC של תאי גזע עובריים ורקמות הסומטית, במיוחד במוח, אולם חקירות על הפצות 5fC ו- 5caC הן מוגבלות.

מעניין, לאחרונה התגלו פרוקריוטים, מתילציה של אדנין שאריות-החנקן בעמדה 6 (N⁶) (6mA) התצוגה שפע גנומית פרופיל ההפוכה לזו של 5mC³⁰. תצפיות כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים טנדם ספקטרומטר מסה לחשוף את 6mA ברמות המוחלטות להתקיים עודף דג זברה, חזירי עוברי מוקדם לעומת זרע עם רמות שלה (0.003% adenines גנומית) גדל בהתמדה על הפריה, לשיא בשלב התפתחותי morula (33 קיפול גבוה יותר מאשר הזרע) ופנייה רמות סומאטית מצב יציב של 0.004% adenines גנומית³¹. Immunoprecipitation של רצפי DNA 6mA מועשר הוכיחה תפוסת הדומיננטית (כ 80% העשרה) של הסימן הזה אזורים יסוד החוזרות על עצמן, התחל תעתיק אתרי³². תצפיות אלה contextualize ולאמת גילוי 6mA demethylase null eתאי גזע mbryonic מפגין 6mA שהצטברו מתווכת להשתיק רטרוטרנספוזון קו-1 בהשוואה ליסודות transcriptionally פעילים בתאים wildtype. נתונים אלו מראים פונקציה רגולטוריות תעתיק עבור 6mA³³.

בעוד מצומדת תגיות הביוכימי מצמידים מבחני מח ש הבאים מצביעים על נוכחות או היעדרות של נגזרות methylcytosine מחמצנים (oxi-mCs), הם לא יכולים להקנות מתפרוסת מרחבית או מידע הניתנת לכימות של אלה סימני^{34, 35}. פרוטוקול לגילוי immunochemical רגיש של 5hmC, 5caC היה שפותחו לאחרונה³⁶. בשיטה זו immunostaining נוגדן מבוססי משני fluorophore מצומדת בשילוב עם ניצול סריקה מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר בעל היתרון הייחודי של מתן חזותיים לוקליזציה של לבצע שינויים אלה דנ א בתוך התאים, לפיכך, שימת דגש על הפרט באופן חיובי או שלילי מוכתם תאים המתאימים עם נוכחות הטרוגנית של הסימנים האלו. עוצמות האות מוחלטת 5hmC ו- 5caC כפי מוגבר על ידי נוגדנים מצומדת מאפשרות פרשנויות למחצה כמותיים להיות הציע על הגודל ועל עמדות של הסימנים האלו בתוך הגרעין למשל heterochromatic ואזורים תהיה ^{37 , 38}. כאן מתוארת שיטה לניתוח חישובית של מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות. הדור של התפוצה המרחבית של 2.5D מתווה להצגת 5hmC ברורים והפגינו 5caC פיקס האות לכל פיקסל ואת מיקומיהם בתוך גרעין האטום. היסטוגרמה מתווה של 5hmC 5caC פרופילים עוצמת האות יכול להמחיש מגמות בשפע של הסימנים האלו כמו הפסגות, שקתות מותוות כמו ערוצים נפרדים שאינם חופפים. לבסוף על-ידי יישום הפונקציה colocalization, ניתן לקבוע את מידת הקרבה של אות אחת לאחרת, כתוצאה מכך, ניתן לזהות קואורדינטות גנומית המתאימים שלהם.