DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析
Summary
新たに発見された 5-メチルシトシン (oxi mCs), 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) の酸化フォームと 5-carboxylcytosine (5caC) は、独自の機能的役割の異なる DNA 変更を表す場合があります。ここの可視化から oxi mCs の空間分布、信号強度プロファイルとの共存の半定量的なワークフローを説明します。
Abstract
数十年、5-メチルシトシン (5mC) は後生動物の機能的意義がある唯一の DNA の変更をすると考えられています。N6-メチルアデニン (6 ma) 多細胞生物の dna の検出と同様、5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxylcytosine (5caC) 5mC の酵素的酸化の発見を提供追加度エピジェネティクスの研究の複雑さ。実験的証拠の成長するボディによるとこれらの新しい DNA の変更は異なる細胞および進化プロセスの特定の役割を果たす可能性があります。重要なこと, これらのマーク (e. g. 5hmC、5 fC と 5caC) 展示組織 – と、脊椎動物で発達段階に固有発生の一部として免疫を表しますにおける DNA 修飾の空間分布の評価を許可する重要なツール異なった生物学的文脈。ここで免疫染色後に共焦点顕微鏡で可視化した DNA 修飾の解析方法を説明します。具体的には、2.5 次元 (2.5 D) の生成信号強度プロット、信号強度プロファイルには、複数の細胞および信号の共存係数の決定における染色の数量が表示されます。総称して、これらの技術が運用レベルと後生動物の生物学的役割の解明に貢献すること、核のこれらの DNA の修正の局在の評価にあります。
Introduction
DNA のメチル化、転写制御に関連付けられているよくとり上げられるメカニズムが伴います、5′-シトシン-リン-グアニン – 3 チトジンの残余の変更 ‘ メチル グループの付加によって (CpG) 型コンテキスト (-CH3) 5-5-メチルシトシン (5mC)1を形成するシトシンのピリミジン環の炭素原子。哺乳類で、消耗して自発的にアミノにチミン25mC 変異原性傾向のおかげでこの回文シーケンスのゲノムの 1% だけを構成する Cpg の約 70% がメチル化します。遺伝子プロモータ配列のメチル グループの存在は、脊椎動物3,4、5の転写抑制と強い相関を示します。非常に節約された DNA メチルトランスフェラーゼ (DNMT) 酵素 DNMT3a、3 b と 3 L、および DNMT1 ・ デ ・ ノボと維持メチル化のコンテキストで CpG シトシンをそれぞれ変更によってこれらのメチル グループの付加を触媒6。DNMT3A/B 式が胚性幹細胞と胚盤葉上層の開発中に昇格します。しかし次の分化8体細胞運命に多能性細胞分化系列決定その減少の発現が観察されます。機能の冗長性を共有しながら DNMT3a と 3b はマウス胚における一様検出 3 a が次と絨毛外胚葉組織8に主にローカライズされた 3b 組織特異的発現パターンを表示します。
メチル化署名は、有糸分裂と減数分裂の10時に継承できます。維持メチル化は、CpG チトジンの残余の二本鎖 DNA11の回文のヘミメチル化で既存の容易に DNMT1 の変更を伴います。DNMT1 の結合 DNA 複製フォーク11とその結果、ゲノムのメチル化レベル12細胞周期の S 期のピーク。DNMT1 現在未変更シトシンにより新たに合成された DNA 鎖を区別する x 染色体の不活性化を推進、転写抑制プロファイル13を維持することでメチル化します。ヘミメチル化 DNA の CpG 配列の認識、DNMT1 はde novo長い散在している核要素 1 (行 1) のメチル化の例:抑圧によって画定のメチル化の確立されたパターンを維持します。その潜在的発癌性伝搬14を阻害するレトロトランスポゾン プロモーター。DNMT1 できます緊急de novoのメチル化役割15 DNMT3a/b -/-の変異細胞の非メチル化 CpG アイランド (CGI) シーケンスをメチル化ヘミメチル化 DNA 優遇結合親和性を有するものの.したがって、DNA 複製16半保守的な性質により維持メチル化は、娘細胞17に親からメチル化署名を忠実に要約することができます。
ただし、遺伝子のと、式を動的に変調、抑圧的なメチル化修飾を消去する必要がありますはパッシブとアクティブの脱メチル化機構18によって達成することができます。ジオキシゲナーゼ蛋白質の保存ファミリーに属する 10-11 Translocase (テト) 蛋白質は、CpG 残基19上のメチル グループの反復的な酸化が可能です。トリパノソーマ bruceiiで発見された J ベース結合蛋白質 (JBP) 相同性の高いこれらの Tet タンパク質認識し、変更された DNA を結合して 5mC などの拠点および 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5 – これらの残基を酸素carboxylcytosine (5caC)20。5 fC と 5caC の変更は 5mC 酸化21,から直接合成することができますしかしテト タンパク質がヒドロキシル基、カルボニルとカルボン酸の構成するメチルから段階的なコンフォメーション変化で 5mC 結果の酸化を促進22,23,24。
テト蛋白質の活動の規制を理解する上での有益な指標は、分布やオキシ-メチル-シトシン マークの豊富さに勉強しています。CpG 悪いプロモーターで重要な 5mC の存在は非メチル化 CpG の豊富な地域とは対照的に検出、CpG の特徴的な後者が諸島25。組織、口腔粘膜を示す最も低いメチル化しながら特定のメチル化は脳、精巣と血で観察される最高の組織間でティッシュ特定の促進者26で発生したメチル化パターンを示します。
敏感な反 5mC と反 5hmC を活用した抗体選択メチル/ヒドロキシメチル DNA 免疫沈降法 (meDIP/hmeDIP) とそれに続く高スループット シーケンス、Ficzらの実証、プロモーターにおける高 5hmC 占有率幹細胞27のエクソンとマウス胚にこれらの場所で減少 5mC レベルと相関線 1 レトロトランスポゾンのシーケンス。逆に、反復的な衛星時系列で観察された最大 5mC 濃縮 5hmC 存在が限られている28。人間の前頭葉脳組織の実施された試験では、非常に重要な 5hmC 濃縮、4 倍以上のマウス胚性幹細胞28を明らかにします。前の所見と一致、5hmC 信号の前頭葉組織図過半数 55 59% の高スループット シーケンス ローカライズ低密度で CpG プロモーター領域、遺伝子体と遺伝子間で約 6% の占有率内 35-38%地域。対照的に、遺伝子体 (52-55%) の中で豊かで遺伝子間領域 (25-26%) と高い 5mC が、プロモーターに削減 (22-24%) シーケンス29。5 fC と 5caC の分布に関する研究は限られているが、これらの研究は胚性幹細胞と体細胞の組織、特に脳、5hmC の豊富なを示します。
興味深いことに、真核生物、6 位窒素 (N6) アデニン残基のメチル化で最近発見された表示 (6 ma) ゲノムの豊富なプロファイル 5mC30の逆。高速液体クロマトグラフィー ・ タンデム質量分析法による観測はシマウマの魚とそのレベル (ゲノム アデニンの 0.003%) と精子と比較してブタ初期胚内に過剰に存在する 6 ma の絶対レベルを明らかにする受精、着実に増加して桑実胚の発達段階 (33 倍精子よりも高い) のピークとゲノム アデニン31の 0.004% の定常体性レベルに達する。免疫沈降濃縮 6 ma DNA シーケンスは、反復要素領域と転写開始サイト32の時はこのマークの優勢な占有率 (およそ 80% 濃縮) を実証しています。これらの観察は文脈し、6 ma デメチラーゼ null e の発見を検証蓄積された 6 ma を展示 mbryonic 幹細胞を介したライン 1 レトロトランスポゾン サイレンシング野生型細胞における転写活性状態の要素と比較しています。これらのデータは、6 ma33転写調節機能をお勧めします。
彼らは分布またはこれらのマーク34,の定量的な情報を伝えることはできませんしながら後続のディップの試金に結合共役の生化学的タグによって指定酸化メチルシトシン誘導体 (oxi mCs) の有無、35です。 最近開発された36才だった 5hmC と 5caC の免疫化学的検出のためのプロトコル。レーザー共焦点顕微鏡を用いた結合この蛍光標識二次抗体を用いた免疫染色メソッドはこのように、細胞内 DNA 変更の視対象定位を提供するユニークな利点を所有しています。肯定的または否定的は染色細胞これらのマークの異種の存在に対応する個人を強調しました。5hmC と 5caC の絶対信号強度に活用された抗体によって増幅する例えばヘテロクロマチンとユークロマチン領域の大きさおよび核内でこれらのマークの位置についての提案する半定量的な解釈を有効にします。37,38。 ここで共焦点顕微鏡画像の解析のための手法を説明します。明確な 5hmC を表示するプロットの 2.5 次元空間分布を生成とピクセルと核内の場所ごとの 5caC 信号のピークを示した。ヒストグラム プロットの 5hmC と 5caC 信号強度分布のピークとしてこれらのマークの豊富さで動向を説明することが谷は別の非オーバー ラップ チャネルとしてプロットされます。最後に、共存機能を実装すると、1 つの信号間の近接の程度を決定することができます、この結果として、彼らのそれぞれのゲノム座標を識別できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、核内で DNA 変更の視覚的な表現を生成する段階的なプロセスについて説明します。ながらインパクトの強い、敏感なこれらの技術は制限数を所有しています。
2.5 D から生成されたデータのプロット、信号強度分布と共局在解析、自然の半定量を強調する必要があります。おかげでレーザー走査型共焦点顕微鏡の画像集録中にサンプルのポイント照明、各チャンネルの信号強度が記録されます。しかし、これらは 5hmC の絶対的な大きさではない、5caC が検出されたとだけ表現の有無またはこれらのエピゲノムのスケールの徴候。
信号増幅の反復的な性質のため必然的に信号を高めるために適用される機械の大きさと一貫性のある制限は、これらのマークの34の本当の物理的なゲノム占有の近似を混同します。これらのマークの実際のゲノムのローカリゼーションは、物理的に 200-300 nm34の最適な共焦点の解像度制限でも解決できない領域を占めるこれらのかさばる蛋白質によって隠される可能性があります。また、抗体の感度や fluorophore 活用34の違いによってお互いにそれぞれのマークの個々 のチャンネルの信号強度を比較できません。しかしゲノムのマークの時空間ダイナミクスのライトを取除くイメージングで得られた情報。
5hmC と 5caC の信号の正確な定量の核が強調され、明確に読み手に分析される領域境界を定める DAPI の対比染色に対して包囲します。この手順は、バック グラウンド ノイズを無視して核1を選択する手動プロセスによって、ゲートのしきい値を調整するための要件を分配します。核分割実行するを可能にする最新のソフトウェアでは、この工程の自動化を実現できます。無料の代替ソフトウェア パッケージなど、フィジー共局在解析、バイナリ 8 ビット形式に画像を変換するための要件などの欠点がありますしながらマスキング画像の領域を選択するサイズ除外データを入力する興味があり制限、このプログラムへのユーザー アクセス。さらに、全体的な限定 5hmC と一般的にユークロマチン領域、ゲノムの CpG 配列の枯渇の優勢な場所と相まってゲノムで 5caC のレベルを考えると、核のマニュアル包囲はユーザー バイアスを紹介します。したがって、自動的に核の強調表示は肯定する区画の地域内で発生するすべてのイベントを前提としています、存在できる背景のピクセルを無視します。したがって、ピクセル強度に基づく画像の分析はより意味のある可能性があります。これらの要因が重要な前提としているピアソンの相関係数に反対すると、信号強度に関係なく、2 つの信号間の空間的重なりの度合いを分析するマンダーの共存係数の使用を検討する際、信号の線形関係は。
全体的に、ここで説明した技術は、直感的な形式で生物学的データの視覚的表現のテーマを運ぶ。半定量的画像解析感度または単一の基本解像度ゲノムの観点から質量分析法などの強力な技術に取って代わることはできませんしながら広い配列する仮説と推論を許可する補完的なデータを提供精密画像の解析から誕生します。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
仕事は、バイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 [アリフールに BB/N005759/1] によって支えられました。NRFH、Rosetrees 信託し、信託 Stoneygate によって資金が供給された [A1130/M546]。ツァイス Elyra PS.1 顕微鏡、処理コンピューターおよびソフトウェアは BBSRC BB/L013827/1 (学際的な超解像度顕微鏡施設ノッティンガム大学助成) によって賄われていた
Materials
| Zeiss Elyra PS1. Super resolution microscope equipped with LSM780 confocal head | Zeiss | NA | |
| Zeiss Zen Black 2012 | Zeiss | NA | |
| Zen Blue 2012 | Zeiss | NA | |
| Microsoft Excel | Microsoft | NA |
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