Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

Metilação do DNA, um mecanismo bem documentado associado com regulamento transcriptional implica modificação de resíduos de citosina em uma 5′-citosina-fosfato-guanina-3′ contexto de dinucleótido (CpG) através da adição de um grupo metilo (-CH₃) ao 5… átomo de carbono do anel pirimidina citosina para formar 5-metilcitosina (5mC)¹. Nos mamíferos, aproximadamente 70% das CpGs são misturados que constitui apenas 1% dos seus genomas, como eles estão esgotados de capicuas sequência devido à propensão mutagénicas 5mC para sofrer espontaneamente a timina². Presença de grupos metil em sequências de promotor do gene mostram forte correlação com repressão transcriptional em vertebrados^3,4,5. Além desses grupos metilo é catalisada por altamente conservadas DNA metiltransferase (DNMT) enzimas DNMT3a, 3b e 3 L e DNMT1 que modificar CpG metiladas em contextos de metilação de novo e manutenção, respectivamente⁶. Expressão Dnmt3a/B é elevada durante o desenvolvimento de células-tronco embrionárias e epiblasto; no entanto sua expressão diminuída é observada após o compromisso de linhagem celular pluripotentes para destinos somáticos durante a diferenciação⁸. Enquanto o compartilhamento de redundância funcional, DNMT3a e 3b exibem padrões de expressão tecido-específica, com 3a detectado uniformemente em embriões de rato mas 3b localizadas predominantemente neuroectoderma e ectoderme gonadotrofina tecidos⁸.

Assinaturas de metilação podem ser herdadas durante a mitose e meiose¹⁰. Metilação de manutenção envolve a modificação de DNMT1 facilitada de resíduos de citosina CpG existentes em palíndromos hemi-misturado em dupla-hélice DNA¹¹. DNMT1 liga DNA em replicação bifurca¹¹ e consequentemente, metilação genômica níveis de pico durante a fase S do ciclo celular¹². DNMT1 mistura sem modificações cytosines desse modo distinguindo de DNA recém sintetizada, promovendo a inativação do cromossomo x e manutenção de perfis de repressão transcriptional¹³. Através do reconhecimento de sequências de DNA CpG hemi-misturado, DNMT1 mantém padrões estabelecidos de metilação demarcados por novo de metilação , por exemplo, repressão de longa Interspersed Nuclear elemento 1 (linha1) retrotransposon promotores para inibir sua propagação potencialmente cancerígenos¹⁴. Embora possua afinidade de ligação preferencial de DNA hemi-misturado, DNMT1 pode misturamos unmethylated CpG sequências de ilha (CGI) em células mutantes DNMT3a/b ^{– / –} , cumprindo um papel de metilação de emergência de novo ¹⁵ . Assim, devido à natureza semi conservador da replicação de DNA¹⁶, metilação de manutenção pode recapitular, fielmente, assinaturas de metilação de pai para filha célula¹⁷.

No entanto, para gene expressão ser modulado dinamicamente, repressiva metilação modificação deve ser apagado, que pode ser alcançado através de de mecanismos de desmetilação ativa e passiva¹⁸. As proteínas de dez-onze Translocase (TET) pertencente a uma família conservada de dioxigenase proteínas são capazes de oxidação iterativa de grupos metilo na CpG resíduos¹⁹. Estas proteínas de Tet, homólogas às proteínas de ligação de J-Base (JBP) descobertas em bruceii tripanossoma, reconhecer e ligar o ADN modificado bases, por exemplo, 5mC e oxigenar a estes resíduos 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5 – carboxylcytosine (5caC)²⁰. Proteína de Tet facilitou a oxidação de 5mC resulta em mudança de conformação progressiva de metil às configurações de hidroxila, carbonila e carboxilato, porém 5fC e 5caC modificações podem ser sintetizadas directamente a partir da oxidação 5mC^{21, 22 , 23 , 24}.

Indicação informativa da atividade de proteína TET na compreensão de sua regulação é estudar a distribuição e abundância de marcas de oxi-metil-citosina. 5mC significativa presença no pobres promotores CpG é detectável em contraste com unmethylated regiões ricas de CpG, sendo este último característico de CpG consoles de²⁵. Através de tecidos, tecido maior metilação específica é observada no cérebro, testículos e sangue enquanto a mucosa oral apresentam maior hypomethylation, indicando um padrão de metilação diferencial ocorrendo no tecido específico promotores²⁶.

Através de utilizando anti-5mC sensível e anti-5hmC anticorpos na seletiva de metilo/hidroximetil DNA imunoprecipitação (meDIP/hmeDIP) e sequenciamento de subsequentes alto throughput, Ficz et al demonstraram 5hmC alta ocupação no promotores, exões e linha-1 retrotransposon sequências que correlacionados com níveis de 5mC reduzida nesses locais no mouse embrionário tronco células²⁷. Inversamente, maior enriquecimento de 5mC foi observado em sequências repetitivas satélite onde 5hmC presença foi limitada²⁸. Estudos realizados no tecido do cérebro humano no lobo frontal revelaram 5hmC altamente significativo enriquecimento, quatro vezes maior do que em células-tronco embrionárias de rato²⁸. Em concordância com as observações anteriores, sequenciamento de alto rendimento de lóbulo frontal tecido ilustrado maioria 55-59% do sinal de 5hmC localizadas na baixa densidade CpG regiões de promotor, 35-38% dentro de corpos de gene e cerca de 6% de ocupação no intergênica regiões. Em contraste, 5mC foi enriquecido em regiões intergênicas (25-26%) e mais alto dentro de corpos de gene (52-55%), mas a reduzida (22-24%) no promotor sequências²⁹. Estes estudos indicam abundância de 5hmC em células-tronco embrionárias e tecidos somáticos, particularmente o cérebro, no entanto, as investigações em distribuições 5fC e 5caC são limitadas.

Curiosamente, recentemente descoberto em eucariontes, metilação de resíduos de adenina no nitrogênio a posição 6 (N.⁶) (6mA) exibir uma abundância de genômica perfil inverso ao de 5mC³⁰. Observações de cromatografia líquida acoplada espectrometria de massa em tandem revelam 6mA níveis absolutos de existir em excesso no peixe-zebra e porcinos embriões adiantados em relação ao esperma com seus níveis (0,003% do genoma adenines) aumenta constantemente em cima de fertilização, atingindo o grau de desenvolvimento de mórula (33 vezes maior do que o esperma) e atingindo níveis somáticos de estado estacionário de 0,004% do genoma adenines³¹. Imunoprecipitação 6mA enriquecido de sequências de ADN demonstrou ocupação predominante (aproximadamente 80% enriquecimento) desta marca em regiões repetitivas elemento e iniciar transcriptional sites³². Estas observações contextualizam e valide a descoberta de 6mA demetilase nulo ecélulas-tronco mbryonic exibindo 6mA acumulada mediada linha-1 retrotransposon silenciar em comparação com elementos transcricionalmente ativos em células de sua. Estes dados sugerem uma função de regulação transcricional para 6mA³³.

Enquanto conjugadas etiquetas bioquímicas acopladas para posteriores ensaios de mergulho indicam a presença ou ausência de derivados oxidados metilcitosina (oxi-mCs), eles não podem transmitir informações quantificáveis destas marcas^34, ou distribuição espacial ³⁵. um protocolo para sensível detecção imunoquímica de 5hmC e 5caC foi recentemente desenvolvido³⁶. Este método de imunocoloração baseados em anticorpo secundário fluoróforo conjugado juntamente com utilizando microscopia confocal laser possui a vantagem exclusiva de fornecer localização visual destas modificações do DNA dentro das células, assim, enfatizando individuais positivamente ou negativamente coradas células correspondente com a heterogênea presença destas marcas. As intensidades de sinal absoluto de 5hmC e 5caC como amplificado por anticorpos conjugados permitem interpretações semi quantitativas a ser proposto sobre a magnitude e as posições destas marcas dentro do núcleo, por exemplo, regiões heterocromático e eucromatina ^{37 , 38}. aqui descrita uma técnica de análise computacional de imagens de microscopia confocal. A geração da distribuição espacial de 2,5 D parcelas para exibir 5hmC distintas e picos de sinal 5caC por pixel e suas localizações dentro de núcleos é demonstrado. Histograma de 5hmC parcelas e 5caC perfis de intensidade de sinal podem ilustrar tendências em abundância destas marcas como os picos e depressões são plotados como canais separados de não-sobreposição. Finalmente, implementando a função colocalization, pode ser determinado o grau de proximidade de um sinal para outro e como resultado, suas respectivas coordenadas genômicas podem ser identificadas.