Иммуноокрашивания для модификации ДНК: Вычислительный анализ конфокальный изображений

Метилирование ДНК, документально механизм, связанный с регуляцию влечет за собой изменение остатков цитозина в 5′-цитозин фосфат гуанин-3′ контексте динуклеотид (CpG) через добавлением метильной группы (-CH₃) на 5- атом углерода цитозина пиримидина кольца в форме 5-метилцитозин (5мс)¹. В млекопитающих около 70% стандартов клинической практики являются метилированию которых составляет лишь 1% от их геномов, как они истощаются палиндром последовательности благодаря 5мс мутагенных склонность к спонтанно deaminate в тимин². Присутствие метильных групп последовательностей гена промоутер показывают сильную корреляцию с транскрипционный анализ репрессий в позвоночных^3,4,5. Помимо этих метильных групп катализируемой высоко сохраняется ДНК метилтрансфераза (DNMT) ферментов DNMT3a, 3b и 3 L и DNMT1, который соответственно изменить CpG cytosines de novo и обслуживания метилирования контекстах⁶. DNMT3A/B выражение возводится во время разработки в эмбриональных стволовых клеток и Эпибласт; Однако его уменьшилась выражение наблюдается после плюрипотентных клеток линии приверженность соматических судьбы во время дифференцировки⁸. Хотя обмен функциональной избыточностью, DNMT3a и 3b отображения образцов ткани конкретных выражений, с 3a, равномерно обнаружены в эмбрионов мыши но 3b, преимущественно локализованы neuroectoderm и хорионического эктодермы тканей⁸.

Метилирование подписей могут быть унаследованы во время митоза и мейоз¹⁰. Техническое обслуживание метилирования включает DNMT1 при содействии модификации остатков цитозина CpG, существующих в hemi метилированную палиндромов двуцепочечной ДНК¹¹. DNMT1 связывается ДНК в репликации вилки¹¹ , и следовательно, геномных метилирования уровнях пик в S-фазе клеточного цикла¹². DNMT1 метилирует неизмененном cytosines таким образом отличительный заново синтезированные нити ДНК, поощрение инактивации х и поддержание транскрипционный анализ репрессий профили¹³. Путем признания hemi метилированную последовательностей ДНК CpG DNMT1 поддерживает установленные шаблоны метилирования хроматического de novo метилирования например репрессии длинные Interspersed ядерный элемент 1 (строка1) Ретротранспозоны промоутеров для ингибирования его потенциально канцерогенных распространения¹⁴. Хотя обладая hemi метилированную ДНК преференциальных сродство, DNMT1 может метилируем unmethylated последовательностей CpG остров (CGI) в DNMT3a/b ^{– / –} мутант клеток, выполняя роль метилирования чрезвычайных de novo ¹⁵ . Таким образом благодаря полу консервативный характер репликации ДНК¹⁶, метилирование обслуживания может добросовестно пилки метилирования подписей от родителей дочь клеток¹⁷.

Однако гена выражение быть динамически модулированных, репрессивных метилирования модификации должны быть стерты, которое может быть достигнуто путем деметилирования пассивные и активные механизмы¹⁸. Десять-одиннадцать белки ацилкарнитин (тет), относящихся к сохраняемой семейству белков dioxygenase способны итеративный окисления метильных групп CpG остатков¹⁹. Эти белки Tet, гомологичных белки, связывающие J-Base (JBP) обнаружил в трипанасомных bruceii, признать и привязать изменение ДНК баз например 5мс и кислородом эти остатки 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) и 5 – carboxylcytosine (5caC)²⁰. Тет белков способствует окисления 5мс результатов в ступенчатой конформации переход от бромистого гидроксил, карбонил и карбоксилат конфигураций, однако 5 ФК и 5caC изменения могут быть синтезированы непосредственно из 5мс окисления^{21, 22 , 23 , 24}.

Информативный проявлением активности белка тет в понимании их регулирование изучает распределения и обилие oxi метил цитозин знаков. 5мс значительное присутствие на ВПУ бедных промоутеров обнаруживаемая в отличие от unmethylated CpG богатые регионы, причем характеристика CpG острова²⁵. Через ткани, высокий ткани, конкретных метилирования наблюдается в мозг, яички и крови, хотя слизистой проявляют наибольшую hypomethylation, указав шаблон дифференциального метилирования, происходящих на ткани конкретных промоутеров²⁶.

Путем использования чувствительных анти 5мс и анти 5hmC антител в выборочной метил/гидроксиметил ДНК иммунопреципитации (МЕДИП/hmeDIP) и последующих высокой пропускной способности последовательности, ФИКЗ et al. продемонстрировал высокий 5hmC размещение на промоутеров, экзонов и линия-1 Ретротранспозоны последовательностей, которые связаны с сокращением 5мс уровней в этих местах в мыши эмбриональные стволовые клетки²⁷. Наоборот величайший 5мс обогащения было отмечено в последовательности повторяющихся Спутниковое где 5hmC присутствие было ограничено²⁸. Исследования на ткани человека лобной доли головного мозга показывают весьма значительные 5hmC обогащения, четыре раза выше, чем в мыши эмбриональные стволовые клетки²⁸. В соответствии с предыдущими замечаниями высокая пропускная способность sequencing лобной доли ткани проиллюстрировано большинство 55-59% 5hmC сигнала локализованы на низкой плотности CpG промоутер регионов, 35-38% в органах гена и приблизительно 6% занятости в intergenic регионах. В противоположность этому 5мс обогатилась в intergenic регионах (25-26%) и выше органах гена (52-55%), но снижение (22-24%), на промоутер последовательностей²⁹. Эти исследования показывают обилие 5hmC в эмбриональных стволовых клеток и соматические ткани, особенно мозга, однако исследования на 5 ФК и 5caC распределения ограничены.

Интересно, что недавно обнаружили у эукариот, метилирование аденин остатков на позиции 6 азота (N⁶) (6mA) дисплей геномной изобилие профиль обратная, 5МС³⁰. Замечания от тандем массовым спектрометрированием жидкостной хроматографии в сочетании выявить 6mA абсолютных уровнях существует в избытке в гиреллы и свинину ранних эмбрионов, по сравнению с спермы с уровнями (0.003% генома adenines) растет на оплодотворение, достигнув морулы стадии развития (33 раза выше, чем сперматозоидов) и достижения устойчивого состояния соматического уровня 0,004% генома adenines³¹. Иммунопреципитация последовательностей ДНК 6mA обогащенный продемонстрировал преобладающим размещение (около 80% обогащения) этой марки в повторяющийся элемент регионов и transcriptional начало сайтов³². Эти наблюдения контекст и проверить открытие e 6mA деметилазы-значение nullmbryonic стволовые клетки экспонируется накопленные 6mA опосредованной глушителей Ретротранспозоны линия-1 по сравнению с транскрипционно активных элементов в wildtype клетках. Эти данные свидетельствуют о транскрипционный анализ функции регулирования для 6mA³³.

Хотя конъюгированных биохимических теги, в сочетании с последующим КУПАНИЕМ анализов указывают на наличие или отсутствие обнаружен окисленных производных (oxi-mCs), они не могут распространять пространственного распределения или количественной информации, эти знаки^{34, 35}. протокол для чувствительных иммунохимических обнаружения 5hmC и 5caC был недавно разработанных³⁶. Этот метод вторичные антитела на основе иммуноокрашивания Флюорофор спрягаются, в сочетании с использованием сканирование лазерная конфокальная микроскопия обладает уникальным преимуществом предоставления визуального локализации этих изменений ДНК в клетках, таким образом, подчеркивая отдельные положительно или отрицательно окрашенных клеток с гетерогенными присутствие этих марок. 5hmC и 5caC сигнал абсолютной интенсивности как усиливается конъюгированных антител включить полуколичественного толкования должны быть предложены о масштабах и позиции этих знаков в ядре, например гетерохроматиновые и эухроматиновых регионов ^{37 , 38}. здесь описана методика для вычислений анализа confocal микроскопии изображений. Поколения 2,5 D пространственного распределения участков для отображения различных 5hmC и проявляется 5caC пики сигнала на пиксел и их расположения в пределах ядер. Гистограмма участков 5hmC и 5caC сигнал интенсивности профили можно проиллюстрировать тенденции в изобилии этих марок как пики и желоба выводятся как отдельные неперекрывающихся каналов. Наконец выполняя функцию colocalization, степень близости одного сигнала на другой может быть определено и в результате этого, могут быть определены их соответствующие геномной координаты.