שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

מחקרים שנעשו לאחרונה חשף תפקיד לשינויים בפי פי במהלך תאית התמיינות ו דיספלסיה ויוו^1,2. מחקרים אלה מצאו שאת פי מתאים להפליא בתאים מאותו סוג בשלב זהה של בידול, אבל זה היא משתנה תוך תאי מעבר משלב אחד למשנהו. במקרים מסוימים, חוסמת חלקית את השינויים בפי פי משבש בידול, טוען כי השינוי שחל פי היא לא רק תוצאה של שינויים בגורל תא אבל במקום זה מסייע לקדם את השינוי בגורל תא, אולי דרך אפקטים על pH רגיש רגולטוריות חלבונים או התגובות הכימיות הדרושות עבור בידול. מחקרים עתידיים יש פוטנציאל כדי לחשוף עוד תובנות התפקידים השונים רבים של pHi dynamics ויוו. עם זאת, אחד האתגרים של הלומדים פי במהלך התמיינות ויוו הוא קבלת מדידות מדויקות של פי פי. שלא כמו תכונות אחרות של בידול, כגון שינויים מורפולוגיה הסלולר וכן ביטוי גנים, pHi הוא נכס כימי יציב של התא זה אינו נשמר בתאים קבוע, permeabilized בשיטות הרגילות. בנוסף, פי ייתכן יציב בתאים לחוצה או גוסס כתוצאה מניפולציה ניסויית. לכן חשוב לשמור תאים חי ובריא ככל האפשר כאשר מודדים את פי. מספר צבעי חיוני זמינות עבודה טוב עבור מדידה על פי של תאים תרבות³, אבל ברבות המקרים הם אינם מתאימים עבור ויוו מחקרים כי הם לא לחדור הרקמות עמוק או באופן שווה מספיק כדי לספק מדידות מדויקות .

כדי לעקוף את הבעיה של חדירה צבע עניים, אנחנו ואחרים השתמשו בדיקה גנטית מקודד, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, זה יכול לבוא לידי ביטוי במיוחד בתא סוגים של הדמיה של רקמת חיים ועניין. pHluorin הוא וריאציה של GFP עם pKa גבוה יותר (~ 7.0 לעומת ~ 4.0) זה מתקפל בקלות רבה יותר ב- pH גבוה יותר; אז עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל הנפלטים אוכלוסייה של pHluorin מולקולות בתא עולה עם הגדלת פי⁸. חשוב, הוא ליניארי בטווח הנורמלי cytosolic פי ערכים. לעומת זאת, ידי קרינה פלואורסצנטית של mCherry (pKa ~ 4.5) חסר רגישות לשינויים pH בטווח cytosolic. אלה שני הכתבים covalently מקושרים ביחד כמו חלבון chimeric יחיד, מקודד על ידי מסגרת קריאה פתוחה יחיד, ולכן הם תמיד נוכחים בכמויות שוות. לכן, היחס בין pHluorin ל mCherry עוצמת קרינה פלואורסצנטית מספק מדידה על פי זה הוא מנורמל לריכוז בדיקה בכל תא. ניתן להמיר את היחס אז הערכות של פי ערכים באמצעות עיקול רגיל שנוצר על ידי השגת את pHluorin אל mCherry יחס רקמות זה יש כבר equilibrated לערכים הידועים pH.

כאן, אנו מתארים את שיטות השימוש mCherry::pHluorin כדי למדוד את פי של שושלת היוחסין FSC אפיתל בשחלה דרוזופילה . רקמת מאופיין היטב זה שימש לדגם היבטים שונים של ביולוגיה אפיתל, כגון תאי גזע התחדשות עצמית ובידול^9,10,11, נדידת תאים קולקטיבית¹² , ולא פיתוח ותחזוקה של התא קוטביות^13,14. האפיתל זקיק מופק על ידי שני FSCs אשר שוכנים בקצה הקדמי של הרקמה במבנה הנקרא ה^15,germarium¹⁶. תאים אלה לחלק באופן קבוע במהלך הבגרות עצמית לחדש ולייצר רומא, שנקרא prefollicle תאים (pFCs), באפשרותך להזין מחדש את הנישה, הופכים FSC או להבדיל לאחד שלושה סוגי תאים שונים זקיק: קוטב תאים, התאים גבעול, או תאי הגוף הראשי זקיק. הראנו קודם לכן זה ברקמת wildtype, שפי עולה בהתמדה במהלך השלבים הראשונים של בידול, בין פי של 6.8 ב FSCs אל 7.0 ב pFCs, 7.3 התאים זקיק². חסימת עלייה זו על ידי RNAi נוקאאוט של כאמצעי ביטוי ubiquitously נתרן/פרוטון חילופי, DNhe2, קשות פוגע בידול pFC, ואילו להגדיל פי על ידי ביטוי של DNhe2 גורם מתון הבחנה עודף פנוטיפ. ממצאים אלה מדגימים כי פי נשמרת stably בשושלת FSC מוקדם, כי זה יכול להיות השפעול מוגדל או מוקטן ויוו. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות כאן כדי למדוד את פי wildtype רקמות או צורות שונות של רקמות מוטציה, לרבות RNAi נוקאאוט או ביטוי באמצעות של Gal4 של עניין, mitotic שיבוטים.