Методы визуализации внутриклеточного рН линии фолликула стволовых клеток в живых тканей яичника дрозофилы

Недавние исследования показали определенную роль для изменения в фи в клеточной дифференциации и Дисплазия в естественных условиях^1,2. Эти исследования показали, что что фи удивительно последовательна в клетках того же типа на той же стадии дифференцировки, но что меняется как клетки переход от одной стадии к другой. В некоторых случаях блокировка изменения в фи частично разрушает дифференциации, предполагая, что изменения в фи является не только следствием изменения в ячейке судьба, но вместо этого помогает для содействия изменениям в судьбе ячейки, возможно, путем воздействия на рН чувствительных регулирования белки или химические реакции, необходимые для дифференциации. Будущие исследования имеют потенциал, чтобы выявить больше проницательность в много различных ролей фи динамика в естественных условиях. Однако одна из задач изучения pHi во время дифференциация в естественных условиях является получение точных измерений Пхи-Пхи. В отличие от других функций дифференциации, такие как изменения в клеточной морфологии и экспрессии генов фи является лабильным химические свойства ячейки, не сохраняется в клетках, которые были исправлены и permeabilized с стандартными методами. Кроме того фи не может быть стабильным в клетках, которые подчеркнули или умирают в результате экспериментальных манипуляций. Таким образом важно сохранить клетки жив и здоров, как возможно, когда измерения фи. Несколько жизненно важных красителей доступны, что работает хорошо для измерения фи клеток в культуре³, но во многих случаях они подходят не для в vivo исследований потому, что они не проникать в ткани, глубоко или равномерно достаточно, чтобы обеспечить точность измерений .

Чтобы обойти проблемы проникновения красителя бедных, мы и другие использовали генетически закодированный зонд, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, которое может быть выражено непосредственно в ячейке типы образов в живых тканей и интерес. pHluorin представляет собой вариант GFP с выше pKa (~ 7.0 против ~ 4.0), более легко складывается при более высоких значениях рН; Таким образом общая флуоресценции интенсивности испускаемого от населения pHluorin молекул в ячейке возрастает с увеличением фи⁸. Важно отметить, что флуоресценции линейной в нормальном цитозольной диапазоне значений фи. В отличие от флуоресценции mCherry (pKa ~ 4.5) является нечувствительным к изменениям рН в цитозольной диапазоне. Эти два Репортеры ковалентно связаны вместе, как единый химерных белков, кодируемых одной открытой чтении кадра, поэтому они всегда присутствуют в равных количествах. Таким образом соотношение pHluorin к интенсивности флуоресценции mCherry обеспечивает измерение фи, нормируется зонд концентрации в каждой ячейке. Коэффициенты затем может быть преобразован оценкам фи значений с помощью стандартной кривой, создаваемый путем получения pHluorin mCherry коэффициенты из тканей, которые были достижение равновесного уровня, к известным рН.

Здесь мы описываем методы для использования mCherry::pHluorin для измерения фи линии эпителиальных FSC в яичнике дрозофилы . Это хорошо изученных ткани был использован для моделирования много различных аспектов эпителиальных биологии, например стволовых клеток самообновления и дифференциации^9,10,11, коллективные клетки миграции¹² , развития и поддержания клеток полярности^13,14. Эпителий фолликула производится двумя FSCs, находящиеся у переднего края ткани в структуре, называемой germarium^15,16. Эти клетки делятся регулярно во взрослом возрасте самостоятельно обновить и производят потомство, называемые prefollicle клетки (ПФУ), которые можно заново ввести нишу и стать FSC или дифференцироваться в один из трех типов клеток различных фолликул: полярные клетки, клетки стебля, или основные клетки фолликула. Мы показали ранее в wildtype ткани, pHi увеличивает устойчиво на ранних стадиях дифференцировки от Пхи примерно 6,8 в FSCs 7.0 в ПФУ, 7.3 в фолликул клетки². Блокирование это увеличение RNAi нокдаун повсеместно выраженной натрия/Протон теплообменника, DNhe2, серьезно ухудшает ПФК дифференциации, тогда как увеличивая Сверхэкспрессия DNhe2 фи вызывает мягкая избыток дифференциация фенотип. Эти результаты демонстрируют фи стабильно сохраняется в начале линии FSC и что это может быть экспериментально увеличивается или уменьшается в естественных условиях. Методы, описанные здесь может использоваться для измерения фи в wildtype ткани или различные виды мутантов тканей, включая RNAi нокдаун или гиперэкспрессия с помощью Gal4 интерес, и митотического клонов.