Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien

Études récentes ont révélé un rôle pour les modifications du pHi pendant cellulaire différenciation et dysplasie en vivo^1,2. Ces études ont montré que pHi est remarquablement constant dans les cellules du même type au même stade de différenciation, mais qu’il change à mesure que les cellules de transition d’un stade à l’autre. Dans certains cas, bloquant les changements pHi partiellement perturbe la différenciation, ce qui suggère que le changement du pHi n’est pas simplement une conséquence des changements dans le sort de la cellule mais contribue plutôt à promouvoir le changement dans le destin cellulaire, peut-être par le biais des effets sur la régulation pH sensibles les protéines ou les réactions chimiques nécessaires à la différenciation. Les études à venir sont susceptibles de révéler plus de perspicacité dans les nombreux différents rôles de pHi dynamics in vivo. Toutefois, l’un des défis d’étudier le pHi au cours de la différenciation in vivo est d’obtenir des mesures précises de pHi. Contrairement à d’autres caractéristiques de différenciation, comme les changements dans la morphologie cellulaire et l’expression des gènes, pHi est une propriété chimique labile de la cellule qui n’est pas conservée dans les cellules qui ont été fixés et perméabilisées avec des méthodes standard. En outre, pHi peut-être pas stable dans les cellules qui sont stressés ou de mourir à la suite de la manipulation expérimentale. Ainsi, il est important de garder les cellules vivant et en bonne santé que possible lors de la mesure de pHi. Plusieurs colorants vitaux sont disponibles que fonctionnent bien pour mesurer le pHi de cellules en culture³, mais dans de nombreux cas, ils ne sont pas appropriées pour in vivo études parce qu’ils ne pénètrent pas le tissu profondément ou uniformément assez pour fournir des mesures précises .

Pour contourner le problème de la pénétration du colorant pauvres, nous et autres avons utilisé une sonde génétiquement encodée, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, qui peut être exprimé plus précisément dans la cellule types d’intérêt et imagés dans des tissus vivants. pHluorin est une variante de GFP avec un pKa plus élevé (~ 7.0 vs ~ 4.0) qui se plie plus facilement à des pH plus élevés ; Si l’intensité de fluorescence totale émise par une population de pHluorin molécules dans la cellule augmente avec le pHi⁸. Ce qui est important, la fluorescence est linéaire dans la plage normale cytosolique des valeurs de pHi. En revanche, la fluorescence de la mCherry (pKa ~ 4,5) est insensible aux variations de pH comprise entre cytosolique. Ces deux journalistes sont liées de façon covalente ensemble comme une seule protéine chimérique, codée par un cadre de lecture unique, donc ils sont toujours présents en quantités égales. Par conséquent, le ratio de pHluorin à l’intensité de la fluorescence mCherry fournit une mesure de pHi qui est normalisée à la concentration de sonde dans chaque cellule. Les ratios peuvent ensuite être convertis aux estimations des valeurs de pHi à l’aide d’une courbe d’étalonnage qui est générée en obtenant la pHluorin mCherry ratios de tissus qui ont été équilibrés à des valeurs de pH connus.

Nous décrivons ici les méthodes pour l’utilisation de mCherry::pHluorin pour mesurer le pHi de la lignée épithéliale de FSC dans l’ovaire de la drosophile . Ce tissu bien caractérisé a été utilisé pour modéliser les nombreux aspects de la biologie épithéliale, tels que les cellules souches autorenouvellement et différenciation^9,10,11, migration des cellules collectives¹² , le développement et la maintenance de la cellule polarité^13,14. L’épithélium folliculaire est produit par deux sociétés qui résident au bord antérieur du tissu dans une structure appelée le germarium^15,16. Ces cellules se divisent régulièrement au cours de l’âge adulte pour se renouveler et de produire des descendants, appelées cellules prefollicle (PFC), qui peuvent rentrer dans la niche et devenir une FSC ou se différencient en un des trois types de cellules différents follicule : cellules polaires, des cellules de tige, ou cellules de l’organisme principal de follicule. Nous avons démontré précédemment que dans les tissus de type sauvage, le pHi augmente progressivement durant les premiers stades de différenciation, d’un pHi environ 6.8 en FSC à 7,0 dans HPF, 7.3 en follicule cellules². Bloquer cette augmentation par ARNi précipitation d’un échangeur de sodium/proton ubiquitaire expresse, DNhe2, altère la différenciation pFC gravement, mais bien que pHi a augmenté la surexpression des DNhe2 entraîne une différenciation excès douce phénotype. Ces résultats démontrent que le pHi est solidement maintenu dans la lignée FSC au début et qu’il peut être expérimentalement augmente ou diminue en vivo. Les méthodes décrites ici peuvent servir à mesurer les pHi en tissu de type sauvage ou diverses formes de tissus mutants, y compris les Arni knockdown ou surexpression utilisant un Gal4 d’intérêt et des clones mitotiques.