Métodos para el pH intracelular de la proyección de imagen del linaje de la célula de vástago del folículo en vivo tejido ovárico de Drosophila

Estudios recientes revelaron un papel para cambios en pHi durante celular diferenciación y displasia en vivo^1,2. Estos estudios encontraron que pHi es notablemente consistente en células del mismo tipo en la misma etapa de diferenciación, pero que cambia como las células de transición de una etapa a otra. En algunos casos, bloqueando parcialmente los cambios en pHi altera la diferenciación, lo que sugiere que el cambio en pHi no es sólo una consecuencia de los cambios de destino de la célula pero en cambio ayuda a promover el cambio de destino de la célula, quizás a través de efectos sobre el pH-sensible a la regulación las proteínas o las reacciones químicas necesarias para la diferenciación. Los estudios futuros tienen el potencial para revelar más información sobre las muchas funciones diferentes del pHi dinámica en vivo. Sin embargo, uno de los desafíos de estudiar la pHi durante la diferenciación en vivo es la obtención de medidas precisas de pHi. A diferencia de otras características de diferenciación, tales como cambios en la morfología celular y expresión génica, pHi es una propiedad química lábil de la célula que no se conserva en las células que se han fijado y permeabilized con métodos estándar. Además, pHi puede no ser estable en las células que están estresadas o muere como resultado de la manipulación experimental. Por lo tanto, es importante mantener las células vivas y tan saludable como sea posible cuando mide pHi. Varios colorantes vitales están disponibles que funcionan bien para medir PI de las células en cultura³, pero en muchos casos no son adecuadas para en vivo los estudios porque no penetran el tejido uniformemente o profundamente bastante para proporcionar mediciones precisas .

Para evitar el problema de la penetración de tinte pobre, nosotros y otros hemos utilizado una sonda genéticamente codificada, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, que puede ser expresado específicamente en la célula tipos de interés y reflejada en tejido vivo. pHluorin es una variante de la GFP con un pKa superior (~ 7,0 vs ~ 4.0) que dobla más fácilmente a pH más alto; así que la intensidad de fluorescencia total emitida por una población de pHluorin de moléculas en la célula aumenta con el aumento del pHi⁸. Lo importante, la fluorescencia es lineal dentro del rango normal citosólico de los valores de la pHi. En contraste, la fluorescencia de mCherry (pKa ~ 4.5) es insensible a los cambios en el pH dentro de la gama citosólica. Estos dos periodistas son covalente juntos como una sola proteína quimérica, codificada por un marco abierto de lectura único, por lo que siempre están presentes en cantidades iguales. Por lo tanto, el de pHluorin a la intensidad de la fluorescencia mCherry proporciona una medida del pHi que es normalizada a la concentración de la sonda en cada célula. Los cocientes se pueden convertir entonces las estimaciones de los valores de la pHi usando una curva estándar generada por obtener la pHluorin mCherry cocientes de los tejidos que han sido equilibrados a valores de pH conocido.

Aquí, describimos los métodos para el uso de mCherry::pHluorin para medir la pHi del linaje epitelial de la FSC en el ovario del Drosophila . Este tejido bien caracterizado se ha utilizado para modelar diferentes aspectos de la biología epitelial, tales como la célula de vástago auto renovación y diferenciación^9,10,11, migración de la célula colectiva¹² , el desarrollo y mantenimiento de celulares polaridad^13,14. El epitelio del folículo se produce por dos remiten que residen en el borde anterior de los tejidos en una estructura llamada el germarium^15,16. Estas células se dividen regularmente durante la edad adulta para la autorrenovación y producir progenie, denominadas células prefollicle (PFC), que pueden volver a entrar en el nicho y convertirse en un FSC o diferenciar en uno de los tres tipos de células del folículo diferentes: las células polares, las células del tallo, o células del folículo del cuerpo principal. Demostramos previamente que en el tejido de tipo salvaje, el PI aumenta constantemente durante las primeras etapas de diferenciación, de una pHi de aproximadamente 6,8 en remiten a 7.0 en PFC, 7.3 en folículo células². Bloqueo este aumento por la caída de ARNi de un intercambiador sodio/protones ubicuo expresada, DNhe2, severamente deteriora diferenciación de pFC, considerando que el aumento de pHi por la sobreexpresión de DNhe2 causa una leve diferenciación de exceso fenotipo. Estos resultados demuestran que el pHi se mantiene estable en el linaje FSC temprano y que pueden ser experimentalmente aumentado o había disminuido en vivo. Los métodos descritos aquí pueden utilizarse para medir pHi en tejido tipo salvaje o diversas formas de tejidos mutantes, incluyendo caída de ARNi o sobreexpresión usando Gal4 de interés y los clones mitotic.