Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Studi recenti hanno rivelato un ruolo per le modifiche a pHi durante cellulari displasia e differenziazione in vivo^1,2. Questi studi hanno trovato che pHi è notevolmente coerenti in cellule dello stesso tipo nella stessa fase di differenziazione, ma che cambia come le cellule di transizione da una fase a altra. In alcuni casi, bloccando le modifiche a pHi parzialmente sconvolge la differenziazione, suggerendo che il cambiamento a pHi non è solo una conseguenza di cambiamenti nel destino della cellula ma invece aiuta a promuovere il cambiamento nel destino della cellula, magari attraverso effetti sulla regolamentazione sensibili al pH proteine o reazioni chimiche necessarie per la differenziazione. Gli studi futuri hanno il potenziale per rivelare più comprensione nei molti ruoli diversi di pHi dynamics in vivo. Tuttavia, una delle sfide di studiare pHi durante il differenziamento in vivo è ottenere misurazioni accurate di pHi. A differenza di altre caratteristiche di differenziazione, quali i cambiamenti nella morfologia cellulare e l’espressione genica, pHi è una proprietà chimica labile della cella che non viene mantenuta in cellule che sono stati corretti e permeabilizzate con metodi standard. Inoltre, pHi può non essere stabile in cellule che sono stressate o morente a seguito di manipolazione sperimentale. Pertanto, è importante mantenere le cellule in vivo e sano come possibile durante la misurazione pHi. Diversi coloranti vitali sono disponibili che funzionano bene per misurare il pHi di cellule in cultura³, ma in molti casi essi non sono adatti per in vivo studi perché non penetrano il tessuto profondamente o uniformemente abbastanza per fornire misurazioni accurate .

Per aggirare il problema della penetrazione del colorante scadente, noi ed altri abbiamo usato una sonda codificata geneticamente, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, che può essere espressa in particolare nella cella tipi di interesse e imaged in tessuto vivo. pHluorin è una variante del GFP con un pKa più alto (~ 7.0 vs ~ 4.0) che si piega più facilmente a pH più alto; così l’intensità di fluorescenza totale emessa da una popolazione di molecole di pHluorin nella cella aumenta con l’aumentare di pHi⁸. D’importanza, la fluorescenza è lineare nel range di normalità citosolico di valori di pHi. In contrasto, la fluorescenza della mCherry (pKa ~ 4.5) è insensibile ai cambiamenti di pH all’interno della gamma citosolica. Questi due giornalisti sono covalentemente insieme come una singola proteina chimerica, codificata da un telaio di sola lettura aperta, in modo che sempre sono presenti in quantità uguali. Di conseguenza, il rapporto di pHluorin per l’intensità di fluorescenza mCherry fornisce una misura del pHi che è normalizzato per la concentrazione di sonda in ogni cella. I rapporti possono quindi essere convertiti alle stime dei valori di pHi utilizzando una curva standard che viene generata ottenendo il pHluorin ai rapporti mCherry da tessuti che sono stati equilibrati a valori di pH noto.

Qui, descriviamo i metodi per l’utilizzo di mCherry::pHluorin per misurare il pHi del lignaggio FSC epiteliale nell’ovaia di Drosophila . Questo tessuto ben caratterizzato è stato utilizzato per modellare i diversi aspetti della biologia, epiteliale, quali cellule staminali auto-rinnovamento e differenziazione^9,10,11, migrazione cellulare collettiva¹² , lo sviluppo e la manutenzione del cellulare polarità^13,14. L’epitelio del follicolo è prodotto da due FSCs che risiedono al bordo anteriore del tessuto in una struttura denominata il germarium^15,16. Queste cellule si dividono regolarmente durante l’età adulta di auto-rinnovarsi e produrre prole, chiamate cellule prefollicle (PFC), che possono immettere nuovamente la nicchia e diventare un FSC o differenziarsi in uno dei tre tipi di cellule del follicolo diversi: polare cellule, cellule di gambo, o cellule del follicolo di corpo principale. Abbiamo indicato precedentemente che nel tessuto wildtype, il pHi aumenta costantemente durante le prime fasi di differenziazione, da un pHi di circa 6.8 in FSCs a 7.0 in PFC, a 7,3 nel follicolo celle². Bloccando questo aumento di RNAi atterramento di uno scambiatore sodio/protone espressa ubiquitariamente, DNhe2, severamente altera la differenziazione di pFC, considerando che l’aumento di pHi di sovraespressione di DNhe2 provoca una lieve differenziazione in eccesso fenotipo. Questi risultati dimostrano che pHi è mantenuto stabile nel lignaggio FSC precoce e che può essere sperimentalmente aumentata o diminuita in vivo. I metodi descritti qui possono essere utilizzati per misurare pHi in tessuto wildtype o varie forme di tessuti mutante, compreso atterramento di RNAi o sovraespressione utilizzando un Gal4 di interesse e cloni mitotici.