Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Estudos recentes revelaram um papel para alterações em pHi durante celular diferenciação e displasia na vivo^1,2. Estes estudos encontraram que pHi é notavelmente consistente nas células do mesmo tipo na mesma fase de diferenciação, mas que muda como células de transição de uma fase para outra. Em alguns casos, bloquear as mudanças na pHi parcialmente interrompe a diferenciação, sugerindo que a mudança na pHi não é apenas uma consequência de alterações no destino da célula, mas em vez disso, ajuda a promover a mudança no destino da célula, talvez através de efeitos no pH sensíveis à regulamentação proteínas ou reações químicas necessárias para diferenciação. Futuros estudos têm o potencial para revelar mais a introspecção as muitos papéis diferentes do pHi dinâmica na vivo. No entanto, um dos desafios de estudar pHi durante a diferenciação na vivo é a obtenção de medições precisas de pHi. Ao contrário de outras características de diferenciação, tais como alterações na morfologia celular e expressão gênica, pHi é uma propriedade química lábil da célula que não é preservada em células que foram fixadas e permeabilizadas com métodos padrão. Além disso, pHi pode não ser estável em células que estão estressadas ou morrendo como resultado de manipulação experimental. Assim, é importante manter as células viva e mais saudável possível quando se mede o pHi. Vários corantes vitais estão disponíveis que funcionam bem para medir o pHi de células em cultura³, mas em muitos casos eles não são adequados na vivo estuda porque eles não penetram o tecido profundamente ou uniformemente o suficiente para fornecer medições precisas .

Para contornar o problema da penetração de corantes pobre, nós e os outros usaram uma sonda geneticamente codificada, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, que pode ser expressa especificamente na célula tipos de interesse e imagem em tecido vivo. pHluorin é uma variante do GFP com uma mais elevada pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) que dobra mais facilmente em um pH mais elevado; Então, a intensidade de fluorescência total emitida por uma população de moléculas de pHluorin na célula aumenta com o aumento de pHi⁸. Importante, a fluorescência é linear dentro da normalidade citosólica dos valores de pHi. Em contraste, a fluorescência de mCherry (pKa ~ 4.5) é insensível a mudanças de pH dentro do intervalo citosólica. Estes dois repórteres estão covalentemente ligados juntos como uma única proteína quimérico, codificada por um frame de leitura aberto único, para que eles sempre estão presentes em quantidades iguais. Portanto, a relação de pHluorin para mCherry intensidade de fluorescência fornece uma medida da pHi que é normalizado para a concentração de sonda em cada célula. Os rácios podem ser então convertidos a estimativas de valores de pHi usando uma curva padrão que é gerada, obtendo o pHluorin mCherry rácios de tecidos que tenham sido incubados para valores de pH conhecido.

Aqui, descrevemos os métodos para usar o mCherry::pHluorin para medir o pHi da linhagem epitelial de FSC no ovário drosófila . Este tecido bem caracterizado tem sido usado para modelar diversos aspectos da biologia epitelial, tais como células-tronco auto-renovação e diferenciação^9,10,11, migração celular coletiva¹² , o desenvolvimento e a manutenção da célula polaridade^13,14. O epitélio do folículo é produzido por dois FSCs que residem na borda anterior do tecido em uma estrutura chamada de^15,o germarium¹⁶. Estas células se dividem regularmente durante a vida adulta para auto renovar e produzir descendência, chamadas células prefollicle (PFC), que podem re-introduzir o nicho e se tornar um FSC ou se diferenciar em um dos três tipos de células do folículo diferentes: as células polares, células do caule, ou células do folículo do corpo principal. Mostramos anteriormente que no tecido de sua, o pHi aumenta progressivamente durante os primeiros estágios de diferenciação, de um pHi de aproximadamente 6,8 na FSCs para 7.0 no PFC, para 7,3 em células de folículo². Bloquear este aumento por RNAi nocaute de um trocador de sódio/próton ubiquitously expressa, DNhe2, severamente prejudica a diferenciação de pFC, Considerando que aumentando pHi superexpressão de DNhe2 provoca uma leve diferenciação em excesso fenótipo. Estes resultados demonstram que pHi estàvel é mantida na linhagem precoce do FSC e experimentalmente que pode ser aumentado ou diminuído na vivo. Os métodos descritos aqui podem ser usados para medir pHi em sua tecido ou várias formas de tecidos mutantes, incluindo knockdown RNAi ou superexpressão usando um Gal4 de interesse e clones mitóticas.