Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Recente studies bleek een rol voor veranderingen in pHi tijdens cellulaire differentiatie en dysplasie in vivo^1,2. Deze studies gevonden dat die pHi strookt opmerkelijk in cellen van hetzelfde type dezelfde stadium van differentiatie, maar dat verandert als de overgang van één fase naar de andere cellen. In sommige gevallen verstoort gedeeltelijk blokkeren van de veranderingen in pHi differentiatie, suggereren dat de verandering in pHi niet alleen een gevolg van veranderingen in het lot van de cel is, maar in plaats daarvan draagt bij tot de bevordering van de verandering in het lot van de cel, misschien via effecten op pH-gevoelige regelgevende eiwitten of chemische reacties die nodig zijn voor differentiatie. Toekomstige studies hebben het potentieel om te onthullen meer inzicht in de vele verschillende rollen van pHi dynamiek in vivo. Echter, een van de uitdagingen van het bestuderen van pHi tijdens differentiatie in vivo is het verkrijgen van nauwkeurige metingen van pHi. In tegenstelling tot andere functies van differentiatie, zoals veranderingen in de morfologie van de cellulaire en genexpressie, is pHi een onstabiele chemische eigenschap van de cel die wordt niet bewaard in cellen die zijn vastgesteld en met standaardmethoden permeabel. Bovendien, pHi mogelijk niet stabiel in cellen die zijn beklemtoond of sterven als gevolg van experimentele manipulatie. Het is dus belangrijk om te houden van cellen in levend en zo gezond mogelijk in bij het meten van pHi. Verschillende essentiële kleurstoffen zijn beschikbaar dat werk goed voor het meten van de pHi van cellen in cultuur-³, maar in veel gevallen zij zijn niet geschikt voor in vivo studies omdat zij doen niet het weefsel doordringen, diep of gelijkmatig voldoende om nauwkeurige metingen .

Om te omzeilen het probleem van de arme kleurstofpenetratie, hebben wij en anderen gebruikt een genetisch gecodeerde sonde, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, dat kan worden uitgedrukt specifiek in de cel soorten belang en verbeelde in levend weefsel. pHluorin is een variant van GFP met een hogere pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) dat past beter bij een hogere pH; Zo verhoogt de intensiteit van de fluorescentie totaal uitgestoten uit een populatie van pHluorin moleculen in de cel met de toenemende pHi⁸. Nog belangrijker is, is de fluorescentie lineaire binnen de normale cytosolische waardebereik pHi. In contrast, de fluorescentie van mCherry (pKa ~ 4.5) is ongevoelig voor pH veranderingen binnen het cytosolische bereik. Deze twee verslaggevers zijn covalent samen als een enkele chimeer eiwit, gecodeerd door een enkele open leesraam, zodat ze altijd in gelijke hoeveelheden aanwezig gekoppeld. De verhouding van pHluorin naar mCherry fluorescentie intensiteit biedt daarom een meting van pHi dat is genormaliseerd naar de concentratie van de sonde in elke cel. De ratio’s kunnen vervolgens worden geconverteerd naar raming van pHi waarden met behulp van een standaard curve die wordt gegenereerd door het verkrijgen van de pHluorin te mCherry ratio’s van weefsels die bekende pH waarden hebben zijn geëquilibreerd.

Hier beschrijven we de methoden voor het gebruik van mCherry::pHluorin voor het meten van de pHi van de epitheliale FSC overdrachtslijn in de Drosophila eierstok. Dit goed gekarakteriseerd weefsel is gebruikt om het model van de vele verschillende aspecten van de epitheliale biologie, zoals de cel van de stam zelf-vernieuwing en differentiatie^9,10,11, collectieve cel migratie¹² , en de ontwikkeling en het onderhoud van^13,14van de polariteit van de cel. Het epitheel van de follikel wordt geproduceerd door twee FSCs die zich op de voorste rand van het weefsel in een structuur genaamd de germarium^{15,16 bevinden}. Deze cellen verdelen regelmatig tijdens volwassenheid zichzelf vernieuwen en produceren nakomelingen, oftewel prefollicle cellen (PFK’s), die kunnen de niche opnieuw in te voeren en geworden een FSC of in een van drie verschillende follikel celtypes te differentiëren: polar cellen, cellen van de stengel, of hoofdtekst follikel cellen. We bleek eerder dat in wildtype weefsel, de pHi gestaag toeneemt tijdens de vroege stadia van differentiatie, vanuit een pHi van ongeveer 6,8 in FSCs naar 7.0 in PFK’s, tot 7.3 in follikel cellen². Het blokkeren van deze stijging door RNAi knockdown van een overal uitgedrukt natrium/proton-wisselaar, DNhe2, ernstig schaadt pFC differentiatie, overwegende dat de toenemende pHi door overexpressie van DNhe2 veroorzaakt een milde overtollige differentiatie fenotype. Deze bevindingen tonen aan dat pHi stabiel in de vroege FSC bloedlijn wordt gehandhaafd en dat het experimenteel kan worden verhoogd of verlaagd in vivo. De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor het meten van pHi wildtype weefsel of verschillende vormen van mutant weefsel, met inbegrip van RNAi knockdown of overexpressie met behulp van een Gal4 van belang, en de mitotische klonen.