أساليب للأس الهيدروجيني "التصوير داخل الخلايا" من "سلالة الخلايا الجذعية جريب" في "أنسجة المبيض" المورفولوجية لايف

كشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا بدور للتغييرات في pHi خلال الخلوي والتمايز وخلل التنسج في فيفو^1،2. تبين هذه الدراسات أن pHi يتسق ملحوظ في الخلايا من نفس النوع في نفس المرحلة من التمايز، ولكن أن يتحول كما الخلايا الانتقال من مرحلة إلى أخرى. وفي بعض الحالات، منع التغييرات في pHi جزئيا يعطل التمايز، مما يوحي بأن التغيير في pHi ليس فقط كنتيجة للتغييرات في مصير الخلية ولكن بدلاً من ذلك يساعد على تشجيع التغيير في مصير الخلية، ربما من خلال الآثار على الأس الهيدروجيني الحساسة التنظيمية بروتينات أو التفاعلات الكيميائية المطلوبة للمفاضلة. دراسات المستقبل لديها القدرة على الكشف عن مزيد من التبصر في أدوار مختلفة كثيرة من pHi الديناميات في فيفو. ومع ذلك، واحداً من التحديات لدراسة pHi أثناء التفريق في فيفو هو الحصول على قياسات دقيقة من pHi. خلافا للميزات الأخرى من التمايز، مثل التغييرات في مورفولوجيا الخلوية والتعبير الجيني، وهو pHi خاصية كيميائية مجا الخلية التي لا يتم الاحتفاظ في الخلايا التي تم إصلاحها وبيرميبيليزيد مع الأساليب القياسية. وبالإضافة إلى ذلك، قد لا يكون pHi مستقرة في الخلايا التي هي أكد أو يموتون نتيجة للتلاعب التجريبية. وبالتالي، من المهم إبقاء الخلايا حية وصحية قدر الإمكان عند قياس pHi. تتوفر العديد من الأصباغ الحيوية أن تعمل بشكل جيد لقياس أي الخلايا في ثقافة³، ولكن في كثير من الحالات أنها ليست مناسبة للدراسات في فيفو نظراً لأنها لا تخترق الأنسجة العميق أو بالتساوي بما يكفي لتوفير قياسات دقيقة .

للالتفاف على مشكلة اختراق صبغ الفقيرة، نحن وآخرون قد استخدمت تحقيق وراثيا مرمزة، mCherry::pHluorin^4،5،،من⁶⁷، التي يمكن التعبير عنها على وجه التحديد في الخلية أنواع الفائدة والمصورة في الأنسجة الحية. فلورين هو البديل للتجارة والنقل مع pKa أعلى (~ 7.0 مقابل ~ 4.0) أن يطوي بسهولة أكبر على درجة الحموضة أعلى؛ حتى يزداد كثافة fluorescence الإجمالية المنبعثة من أن جزيئات فلورين في الخلية مع تزايد pHi⁸. الأهم من ذلك، الفلورية الخطية داخل نطاق القيم pHi سيتوسوليك العادية. وفي المقابل، الأسفار مشري (pKa ~ 4.5) هو حساس لتغيرات درجة الحموضة داخل النطاق سيتوسوليك. هذه اثنين من الصحفيين تساهمي ترتبط معا بروتين تشيميريك واحد، مرمزة بواسطة إطار قراءة مفتوحة واحدة، حيث تكون دائماً موجودة بكميات متساوية. ولذلك، يوفر نسبة فلورين إلى مشري fluorescence كثافة قياس pHi هو تطبيع لتركيز التحقيق في كل خلية. ثم يمكن تحويل النسب إلى تقديرات القيم pHi استخدام منحنى قياسية التي يتم إنشاؤها بواسطة الحصول على فلورين نسب مشري من الأنسجة التي قد تم اكويليبراتيد لقيم الأس الهيدروجيني المعروفة.

هنا، يمكننا وصف الأساليب لاستخدام mCherry::pHluorin لقياس pHi سلالة FSC الظهارية في المبيض المورفولوجية . قد استخدمت هذا النسيج تتسم جيدا لنموذج العديد من الجوانب المختلفة للبيولوجيا الظهارية، مثل الخلايا الجذعية الذاتي تجديد والتمايز^9،10،11، الهجرة الجماعية الخلية¹² ، وتطوير وصيانة الخلية القطبية^13،14. ظهارة جريب ينتج اثنين التابعة الموجودة في الحافة الأمامية للأنسجة في بنية تسمى ال^15،جيرماريوم¹⁶. انقسام هذه الخلايا بشكل منتظم خلال مرحلة البلوغ تجديد نفسها وتنتج ذرية، تسمى خلايا بريفوليكلي (pFCs)، الذي يمكنه إعادة إدخال المكانة وتصبح منتدى التعاون الأمني أو تفرق في واحدة من ثلاثة أنواع الخلايا جريب مختلفة: الخلايا القطبية، وساق الخلايا، أو خلايا الجسم الرئيسي جريب. أظهرنا سابقا أن في الأنسجة wildtype، pHi يزيد مطردا خلال المراحل المبكرة من التمايز، من pHi حوالي 6.8 في التابعة إلى 7.0 في الهيدروكربون المشبع بالفلور، إلى 7.3 في جريب الخلايا². حظر هذه الزيادة بواسطة [رني] ضربة قاضية مبادل الصوديوم/بروتون أعرب عن أوبيكويتوسلي، DNhe2، شدة يضعف التمايز الهيدروكربون المشبع بالفلور، بينما زيادة pHi overexpression من DNhe2 الأسباب تفريق الزائد خفيف النمط الظاهري. تبين هذه النتائج أن pHi ثابت يحتفظ في النسب منتدى التعاون الأمني مبكرا، وأنه يمكن أن يكون تجريبيا تزيد أو تنقص في فيفو. يمكن استخدام الأساليب المذكورة هنا لقياس pHi في الأنسجة wildtype أو أشكال مختلفة من الأنسجة متحولة، بما في ذلك [رني] ضربة قاضية أو أوفيريكسبريسيون باستخدام Gal4 الفائدة، واستنساخ الانقسامية.