Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

1. digestione del DNA con nucleasi di Micrococcal Eseguire una reazione di ottimizzazione per ogni nuovo lotto di enzima nucleasi di micrococcal (MNase).Nota: Il numero di unità di MNase utilizzati deve essere verificato (utilizzando una diluizione seriale, Figura 2A). Di solito, 5-10 U di MNase digerire 1 µ g di purificato genomico o DNA di BAC a un intervallo di 5-100 bp con le condizioni descritte di seguito. Per reazione, impostare 1 µ l di tampone MNase 10x, albumina di siero bovino (BSA), 1 µ g di DNA, 1 µ l di MNase bersaglio: 1x (0,1-50 unità) in un volume di reazione di 10 µ l. Incubare a 37 ° C per 15 min. Immediatamente inattivare l’enzima aggiungendo 1 µ l di 500mm glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA). 2. separazione del DNA frammenti mediante elettroforesi in Gel di poliacrilamide (pagina) Aggiungere tampone campione/tintura di campioni di DNA di caricamento del gel e caricare su un 20% gel PAGE. Caricare una scaletta di DNA appropriata per dimensionamento (5 bp DNA Ladder). Non sovraccaricare il gel (1 µ g del DNA per pozzetto). Eseguire gel appropriato 1x TRIS-Borato-EDTA (TBE) in esecuzione nel buffer in corrispondenza 150 V (costante) per circa 1,5 h o fino alla parte anteriore inferiore della tintura (bromofenolo, blu scuro di colore blu) che viaggia intorno alle 15 bp, raggiunge l’estremità inferiore del gel. Macchia il gel usando una macchia di ultra-sensibile dell’acido nucleico e visualizzare sotto luce UV. Dall’immagine gel, determinare la concentrazione ottimale di MNase per la digestione del DNA fino a 20-30 bp in dimensione. Utilizzare la concentrazione ottimizzata di MNase per digerire il DNA bersaglio ripetendo i passaggi 1.2-2.2. Di solito, configurazione 10-12 reazioni (cioè 10-12 µ g del materiale di partenza totale) produrrà abbastanza digerito DNA estrazione gel pagina seguente per procedere ai passaggi successivi. Usando un bisturi sterile, tagliare il gel adiacente alla corsia di marcatore e macchia solo la parte del gel che contiene la scala con fresco 1 x TBE in esecuzione tampone contenente 1 X di una macchia di ultra-sensibile dell’acido nucleico. Visualizzare il DNA ladder e asportare frammenti di DNA digerito MNase nell’intervallo di dimensioni tra circa 18-30 bp usando una lama di rasoio.Nota: Evitare di esporre i frammenti digeriti MNase ai raggi UV. È possibile utilizzare una sorgente di luce blu (invece di UV) o prendere un’immagine della scala sotto UV, stamparlo per ridimensionare e utilizzare questo per guidare l’asportazione dei frammenti del DNA digerito di MNase). Questo passaggio evita la macchiatura e l’esposizione di frammenti di DNA a luce UV. Utilizzare sempre un bisturi monouso sterili, inutilizzati o lama di rasoio per questo passo per evitare la contaminazione. Trasferire la fetta di gel a un tubo del microcentrifuge. Macchiare il resto del gel con acido nucleico macchia come sopra, esporre ai raggi UV e registrare un’immagine per tenere traccia del passaggio di asportazione del gel. 3. isolamento dei frammenti di DNA dai gel di pagina utilizzando il metodo di ammollo e Crush Nota: Questo passaggio è stato adottato da Sambrook et al. 11 Preparare la pagina gel tampone di solubilizzazione (1,88 mL di acetato di ammonio 4 M, 150 µ l di acetato di magnesio 1 M, 30 µ l di 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (pH 8) in ultrapura H2O a un volume totale di 15 mL). Schiacciare la fetta asportato gel contro la parete del tubo micro-centrifuga utilizzando una pipetta sterile. Aggiungere 2 volumi di tampone di solubilizzazione pagina del gel e incubare a 37 ° C per 16 ore su una piattaforma rotante. Centrifugare i campioni per 1 min alla massima velocità in una microcentrifuga. Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge, facendo attenzione a non per trasferire eventuali pezzi gel schiacciato. Aggiungere 0,5 volumi di tampone di solubilizzazione di pagina al gel a pellet, vortice, quindi ripetere la centrifugazione (punto 3.4). Combinare i sovranatante. Estrarre i frammenti di DNA mediante estrazione del fenolo-cloroformio standard.Attenzione: Fenolo è tossico se viene a contatto con la pelle e per ingestione. Precauzioni di sicurezza come guanti, occhiali protettivi, camice da laboratorio e lavorando in una cappa sono critici. Smaltire tutti i rifiuti contenenti fenolo secondo le normative dell’Istituto. Aggiungere un volume del fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) per il campione e il vortice accuratamente. Centrifugare per 10 minuti alla massima velocità (16.000 x g) in una centrifuga da tavolo a temperatura ambiente. Trasferire con cautela la fase acquosa superiore ad un tubo del microcentrifuge fresco. Fare attenzione a non per portare sopra qualsiasi fenolo durante il pipettaggio. Ripetere i passaggi 3.6.1 e 3.6.2 una volta. Aggiungere una piccola quantità (0,2 µ l) di glicogeno, 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (pH 5.2) e 2 volumi di 100% etanolo (EtOH). Vortex e incubare a-20 ° C per diverse ore o durante la notte. Centrifuga per 30 min a velocità massima a 4 ° C, utilizzando una centrifuga da tavolo. Con attenzione rimuovere il surnatante e lavare la pallina di DNA con 70% EtOH. Centrifuga per 30 min a velocità massima a 4 ° C, utilizzando una centrifuga da tavolo. Rimuovere il supernatante e asciugare all’aria il pellet di DNA. Assicurarsi che tutti l’EtOH evaporato, ma fare attenzione a non asciugare troppo il pellet. Sciogliere i pellet di DNA in 12 µ l di H2O.Nota: Estrazione del gel di pagina è molto inefficiente. Per ogni 10 µ g di DNA digerito con MNase di avviamento, si aspettano di recuperare ng 1-20 di frammenti purificati dopo estrazione del gel. Controllare la quantità e l’integrità dei frammenti di caricamento 1/6th (2 µ l) su un gel di pagina (Figura 2). 4. fine riparazione dei frammenti MNase-digerito, Gel-purificato Impostare la seguente reazione utilizzando un DNA smussamento kit: 10 µ l di DNA purificato dal passaggio 3.6.10, 1,5 µ l di 10 X smussamento buffer, 1,5 µ l di miscela del dNTP 1 mM, 0,6 µ l di enzima smussamento, 1,4 µ l di H2O. Incubare a 22 ° C per 30 minuti e poi calore-inattivare l’enzima mediante incubazione a 70 ° C per 10 min. Aggiungere 85 µ l di H2O ed eseguire un reazione clean-up usando fenolo/cloroformio-estrazione standard ed EtOH-precipitazione (come descritto nella sezione 3.6). Procedere immediatamente alla legatura del linker. 5. linker generazione Nota: Linkers necessario essere amplificato in parallelo con la sezione 3 per essere in grado di procedere immediatamente con la legatura del linker. Sequenze dell’iniettore utilizzati di seguito devono essere appropriati per il vettore di espressione gRNA selezionate. Quelle qui presentate sono state progettate per il vettore pgRNA-pLKO.1. 9 per l’amplificazione del linker 5′ da pgRNA-pLKO.1, utilizzare il primer sequenze 5′-linker-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) e 5′-linker-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), producendo un amplicone bp 689. Per l’amplificazione del linker 3′ da pgRNA-pLKO.1, utilizzare il primer 3′-linker-f: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) e 3′-linker-r: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), che producono un amplicone bp 848. PCR-amplificare l’adattatore sequenze dal vettore di espressione di gRNA (utilizzando reagenti di scelta e sequenze dell’iniettore personalizzati, se necessario). Per impostare la seguente reazione di PCR di 50 µ l di pgRNA-pLKO.1: 25 µ l di mix master PCR, 2,5 µ l di primer F (10 µM), 2,5 µ l di primer R (10 µM), 0,1 ng di vettore di espressione gRNA (pgRNA-pLKO.1) in H2O. Incubare le reazioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo di 98 ° C per 30 s, 32 cicli 98 ° C per 10 s, 59 ° C per 10 s, 72 ° C per 30 s, 1 ciclo di 72 ° C per 10 min. Purificare le reazioni di PCR usando i branelli reversibile immobilizzazione in fase solida secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 30 µ l di H2O. Per applicare la legatura direzionale del linker per i frammenti di DNA fine-riparato, MNase-digerito, linker digest con enzimi di restrizione appropriati (qui HindIII e SacII). Impostare le seguenti reazioni: Per la digestione del 5′ linker con HindIII, utilizzare 30 µ l di 5′ purificata del linker amplicon dal punto 5.3., 5 µ l di tampone, 3 µ l di HindIII (20U / µ l) e 12 µ l di H2O. Per la digestione del 3′ linker con SacII, utilizzare 30 µ l di 3′ purificata del linker amplicon dal punto 5.3., 5 µ l di tampone, 3 µ l di SacII (20 U / µ l) e 12 µ l di H2O. Incubare digest a 37 ° C per 3 h. Aggiungere tintura di caricamento del gel del DNA ed eseguire il digest di enzima di restrizione su un gel di agarosio 1%. Asportare le bande a 637 bp (digest del linker 5′) e 295 bp (3′ digest del linker). Purificare il DNA dai pezzi gel asportato utilizzando un kit di estrazione del gel. 6. linker legatura e amplificazione degli inserti Impostare una reazione di legatura 14 µ l utilizzando quantità equimolari di frammenti MNase-digerito, fine-riparato e sequenze del linker.Nota: Il Linker di rapporti di frammento potrebbe essere ottimizzato. Si consiglia di includere una reazione di controllo no-frammento (NFC). Uso 5 ng di MNase-digerito frammenti (fine-riparato e purificato), 120 ng del 5′ linker (HindIII digest, purificato), 55 ng di 3′ linker (Sacdigest II, purificato), 1,4 µ l della ligasi T4 Buffer e 1,4 µ l di concentrato T4 DNA ligasi in H2O. Incubare le reazioni di legatura a 16 ° C per 16 h. Fare non calore-inattivare l’enzima. Procedere immediatamente alla scalfittura-traduzione.Nota: I frammenti digeriti MNase fine-riparato forniscono i 5′ fosfati necessari per la legatura di linkers, come il linker stessi sono ONU-fosforilati. Per la legatura reazione (e la reazione di NFC) aggiungere la seguente: 25 µ l di Taq 2 X mix master (capace di traduzione di nick), 2,5 µ l di primer Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2,5 µ l di primer Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) e 6 µ l di H2O. Includere un controllo di modello di no (NTC). Incubare le reazioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo (traduzione di scalfittura): 72 ° C per 20 min, 1 ciclo: 95 ° C per 5 min, 3-4 cicli: 95 ° C per 15 s, 58 ° C per 15 s, 72 ° C per 30 s, 1 ciclo: 72 ° C per 5 min. Eseguire un reazione clean-up usando le perle di immobilizzazione reversibile in fase solida con un campione di rapporto perlina di 1:1. Eluire in 40 µ l di H2O. Amplificare ulteriormente il frammento desiderato (5′ linker + MNase + 3 del frammento ‘ linker) utilizzando i reagenti PCR appropriati e i seguenti primer: Utilizzare 12,5 µ l di master mix PCR, 1.25 µ l di primer Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1.25 µ l di primer Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 2,5 µ l di prodotto di traduzione di nick purificata dal punto 6.4. e 7,5 µ l di H2O. utilizzare le seguenti condizioni: 1 ciclo: 98 ° C per 30 s, 10-16 cicli: 98 ° C per 10 s, 63 ° C per 10 s, 72 ° C per 15 s, 1 ciclo: 72 ° C per 10 min.Nota: Se necessario, parecchie reazioni possono essere impostare in parallelo per garantire che c’è abbastanza prodotto di PCR per i passaggi successivi. Per visualizzare piccole quantità di prodotto di PCR su un gel di agarosio, impostare ulteriori reazioni come descritto al punto 6.5 e aumentare il numero di cicli da 15 a 32. Questa reazione può essere utilizzata come controllo di qualità, se ampliconi non sono visibili dopo 15 cicli. Includono anche un controllo privo di templato (NTC). 7. formato selezione Nota: Questo passaggio separa MNase-frammenti con il linker di 5′ e 3′ montato correttamente da frammenti con due 5′ o i due 3′ linker basato sulla dimensione. Combinare tutte le reazioni di PCR 15-ciclo dal punto 6.5., aggiungere DNA della tintura di caricamento e correre su un gel di agarosio 0.8%. Asportare la fascia prominente a 869 bp e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel. Quantificare la quantità di DNA (ad esempio utilizzando uno spettrofotometro). 8. clonazione di frammenti di PCR-amplificato in gRNA vettore di espressione dall’Assemblea di Gibson Preparare Assemblea master mix come segue:Nota: I seguenti passaggi sono adattati da Gibson et al. 12. Creare 6 mL di tampone di reazione isotermica combinando 3 mL di 1 M Tris (idrossimetil) amminometano (Tris)-HCl pH 7.5, 300 µ l di 1 M MgCl, 60 µ l di trifosfato di 100mm deossiguanosina (dGTP), 60 µ l di trifosfato di deossiadenosina 100mm (dATP) 60 µ l di 100 mM deossitimidina trifosfato (dTTP), 60 µ l di deoxycytidine trifosfato di 100mm (dCTP), 300 µ l di 1 M ditiotreitolo (DTT), 1,5 g di polietilenglicole (PEG) -8000, 300 µ l di 100 mM di nicotinamide adenindinucleotide (NAD) in ultrapura H2O.Nota: Questo buffer può essere aliquotati e conservati a-20 ° C. Creare mix master di 1,2 mL Assemblea combinando 320 µ l di tampone di reazione isotermica: 5x, 3 µ l di 10 esonucleasi T5 U / µ l, 20 µ l di 2 U / µ l DNA polimerasi, 160 µ l di 40 U / µ l DNA ligasi in H ultrapura2O. uso 15 µ l di mix master Assemblea con 5 µ l di inserire.Nota: Il mix master di montaggio può essere aliquotati e conservati a-20 ° C, dove è stabile per più di un anno e può tollerare più cicli di gelo-disgelo. La quantità di exonuclease T5 è ideale per l’utilizzo con lunghe sporgenze. Digestione di spina dorsale di vettoreNota: Assicurarsi di digerire una quantità sufficiente di vettore come input per il numero desiderato di reazioni di montaggio al punto 8.3. Per reazione, aggiungere quanto segue: 1,5 µ g di vettore di espressione gRNA (pgRNA-pLKO.1), 5 µ l di tampone, 1,5 µ l di etàdigerire il mi (5 u / µ l) e 38,5 µ l di H2O. Incubare a 37 ° C per 2 h. Defosforilazione del vettore linearizzato.Nota: Questo passaggio è consigliato, ma non strettamente necessario. T5 esonucleasi nel mix master rimuoverà principalmente l’ etàsovrasta prima la Taq DNA ligasi ha avuto la possibilità di agire. Di conseguenza, non è previsto eccessiva ri-legatura del vettore. Aggiungere 2,5 µ l di enzima fosfatasi alcalina di gamberetti (rSAP, 1 U / µ l). Incubare a 37 ° C per 30 min e quindi inattivare l’enzima incubando a 65 ° C per 5 min. Eseguire la purificazione del DNANota: Si consiglia di eseguire una fase di estrazione del gel dell’agarosi. In alternativa, purificazione colonna – o tallone può essere utilizzato. È importante controllare che la digestione di vettore è completa, ad esempio mediante elettroforesi su gel di agarosio. Per il confronto, non digerito vettore deve essere eseguito in parallelo. Quantificare l’importo del vettore digerito purificato nel campione. Impostare l’assembly con 2 volte eccesso molare di inserti per vector. A 20 µ l reazione uso 100 ng di vettore (etàio digerisco dal punto 8.5), 12,2 ng di inserire (dal punto 7.1.), 15 µ l di mix master di montaggio dal punto 8.1.2. in H2O. Incubare a 50 ° C per 1 h. Purificare le reazioni usando purificazione colonna. Risospendere il DNA in 75 µ l di H2O (o volume a seconda della scala dell’elettroporazione del caso).Nota: L’efficienza di trasformazione dipende notevolmente dalla purezza del DNA. Fasi di purificazione supplementare (ad es. estrazione del fenolo/cloroformio) potrebbero migliorare l’efficienza. 9. preparazione delle cellule di e. coli TG1 Electro-competente Assicurarsi che tutti centrifugare bottiglie e boccette sono liberi dai detergenti sciacquando e successivo riempimento con acqua distillata prima di sterilizzazione in autoclave.Nota: Questo passaggio consente di eliminare eventuali impurità che possano pregiudicare l’efficienza di trasformazione. Acqua deve essere eliminato immediatamente prima dell’uso. In alternativa, uso di bottiglie monouso centrifugazione potrebbe essere consigliabile. Garantire che centrifuga flaconi e soluzioni utilizzate per la preparazione delle celle electrocompetent sono refrigerati il priore di ghiaccio da utilizzare. Si consiglia di eseguire la procedura seguente in una cella frigorifera per ridurre al minimo le fluttuazioni di temperatura che possono influenzare l’efficienza di trasformazione. Preparare il supporto di 2TY. 16 g di bacto triptone, 10 g di Estratto di lievito e 5 g di NaCl, aggiungere acqua distillata 1 L, mix e autoclave. Conservare il medium a temperatura ambiente. Preparare piatti di analisi biologica 2TY-agar rivestito e 10cm Petri che contengono l’antibiotico adatto. Conservare le piastre a 4 ° C.Nota: La scelta dell’antibiotico dipende dalla natura del vettore di espressione gRNA, uso 100 µ g/mL ampicillina per pgRNA-pLKO.1. Raschiare da uno stock di glicerolo di TG1 celle per inoculare 10 mL di medium 2TY (senza antibiotici). Incubare la coltura a 37 ° C durante la notte (~ 16 h) con agitazione a 225 giri/min. Inoculare 1 L di 2TY medio (senza antibiotici) con 10 mL di coltura durante la notte (diluizione 1/100) e dividere in parti uguali tra due boccette di 2L (contenente i deflettori). Incubare la coltura a 37 ° C, 225 giri/min fino a raggiungere un OD600 nm di 0,55 (dopo circa 1,5-2 h). Utilizzare uno spettrofotometro per controllare regolarmente OD600 nm. Chill culture in ghiaccio per 30 min. Dividere la cultura ugualmente fra quattro bottiglie da 500 mL centrifuga (pre-refrigerati sul ghiaccio). Centrifuga per 15 min a 4.000 x g a 4 ° C in una centrifuga pre-refrigerata. Decantare surnatanti e aggiungere 1 volume (ovvero 250 mL) di pre-refrigerati ghiacciata sterile distillata H2O a ciascuna delle bottiglie della centrifuga. Risospendere il pellet batterico agitando o invertendo la bottiglia (o pipettando delicato, se necessario).Nota: È più facile risospendere il pellet aggiungendo prima un piccolo volume di acqua. Assicurarsi che il pellet è completamente in sospensione alla fine. Centrifuga per 15 min a 4.000 x g a 4 ° C. Ripetere il lavaggio due volte (passi 9.12. e 9,13). Eliminare il surnatante. Prestare attenzione quando decantazione come il pellet batterico diventa sempre più sciolto dopo il lavaggio. Risospendere il pellet in 50 mL di glicerolo al 10% sterile, ghiacciata e trasferirlo in una provetta da centrifuga refrigerata pre-50 mL. Centrifugare le cellule per 15 min a ~ 4.000 x g a 4 ° C. Rimuovere con cautela il supernatante. Risospendere delicatamente i batteri in 2 mL di glicerolo 10% sterile ghiacciata. Tenere il ghiaccio se le cellule devono essere utilizzati immediatamente per elettroporazione.Nota: Le cellule possono essere congelate in aliquote di 50 µ l in provette da 0,5 mL in un bagno di ghiaccio secco etanolo e conservate a-80 ° C, ma questo non è consigliato. 10. elettroporazione delle cellule di e. coli TG1 Electrocompetent Nota: L’elettroporazione è uno dei colli di bottiglia nella generazione della libreria completa. Per preservare la rappresentazione di libreria, si consiglia di condurre reazioni individuali elettroporazione come molti come necessario/praticabile e di eseguire le operazioni di controllo di qualità descritte di seguito (10.6. e 10.8.). Aliquotare le reazioni purificate (dal passaggio 8,8) in PCR sterili e pre-refrigerati tubi e tenerli su ghiaccio (1 µ l per provetta). Raffreddare le provette di elettroporazione gap di 1 mm sul ghiaccio. Aggiungere 25 µ l di cellule TG1 preparate direttamente ad un’aliquota del DNA e trasferire immediatamente la miscela in una cuvetta di elettroporazione. Scorri o tocca la cuvetta per garantire che il mix di cellule/DNA è distribuito lungo la lunghezza della cuvetta camera (senza aria intrappolata o bolle). Disponga la provetta nella camera di diapositiva e avviare il programma di elettroporazione appropriato (ad esempio: 1 impulso di 1,8 kV (EC1)).Nota: La costante di tempo dovrebbe essere compresa tra 5,7 e 6,0 ms. nel caso in cui gli archi electroporator, scorri la cuvetta, garantire non ci sono senza bolle d’aria nella camera e riprovare. Aggiungere immediatamente 975 µ l di temperatura 2TY medio per la cuvetta. Utilizzando una pipetta di trasferimento, spostare i batteri individulamente in una provetta da 50 mL. Ripetere dal punto 10.2. e raccogliere tutte le cellule trasformate con una libreria in una provetta da 50 mL. Il volume totale del documento. Passaggio di controllo di qualità Per quantificare la competenza delle cellule electro-competenti appena generate, eseguire una reazione di elettroporazione separati usando una quantità definita di uncut plasmide DNA (ad es. 10 pg pUC19 controllo plasmide). Trasferire questo in una provetta di microfuge 1,5 mL.Nota: La competenza dovrebbe essere almeno 1010 unità formanti colonie (cfu) per µ g di DNA. Preparate le cellule solitamente eseguire meglio di questo. Incubare i batteri trasformati a 37 ° C per 60 min agitazione a 225 giri/min. Passaggio di controllo di qualità: Piastra di una piccola quantità definita di batteri trasformati con la libreria (ad es. 10 µ l di una diluizione di 10-100 volte) su una piastra di agar di 10 cm con la selezione antibiotica appropriata.Nota: Conoscendo il volume totale della cultura (dal punto 10.6.), il numero di Colonia ottenuta consente di stimare il numero totale di colonie per l’intera libreria. 20-30 volte rappresentazione della libreria idealmente dovrebbe essere mantenuta. Disperdere il resto dei batteri sulla 2TY agar rivestito analisi biologica piatti contenenti la selezione antibiotica appropriata.Nota: Il volume della cultura può essere ridotto mediante centrifugazione a ~ 4.000 x g per 10 minuti (o fino a quando si è formata una pallina visibile e il surnatante appare chiaro). Questo riduce il tempo piastre bisogno di asciugare dopo la diffusione della cultura. Utilizzo di piastre anziché coltura liquida riduce al minimo la crescita sproporzionata di diverse colonie. 13 Diffondere un appropriato volume della reazione di elettroporazione del pUC19 controllo su un piatto di agar ulteriori 10cm con selezione antibiotica appropriata. Incubare le piastre di agar durante la notte (16h) a 37 ° C. Conteggio colonie ottenute sulle piastre di controllo (piastra di libreria pUC19 e controllo) per stimare CFU / µ g di DNA per i batteri così come complessità di biblioteca. 11. estrazione del DNA del plasmide Aggiungere 10 mL di media 2-TY per le piastre durante la notte, raschiare il livello batterico fuori la piastra utilizzando una spatola monouso e raccoglierlo in una provetta da 50 mL. Ripetere un paio di volte finché non appare pulito tutto il piatto. Estrazione del DNA utilizzando un kit di plasmide Maxi (2-3 colonne necessarie al saggio biologico piastra).