Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

1. de spijsvertering van DNA met Micrococcal Nuclease Het uitvoeren van een optimalisatie-reactie voor elke nieuwe partij micrococcal nuclease enzym (MNase).Opmerking: Het aantal eenheden van MNase gebruikt moet worden getest (met behulp van een seriële verdunning, figuur 2A). Meestal 5-10 U van MNase verteren 1 µg gezuiverd genomic of BAC DNA tot een bereik van 5-100 bp met de voorwaarden die hieronder worden beschreven. Per reactie, opgericht 1 µL van 10 x MNase Buffer, 1 x bovien serumalbumine (BSA), 1 microgram van doelDNA, 1 µL van MNase (0.1-50 eenheden) in een 10 µL reactie volume. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Onmiddellijk de inactivering van het enzym door toevoeging van 1 µL van 500 mM ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA). 2. scheiding van DNA fragmenten met behulp van Polyacrylamide gelelektroforese (pagina) Voeg monster buffer/gel laden kleurstof aan DNA-monsters en laden op een 20% pagina gel. Laden van een geschikte DNA-ladder voor de dimensionering (5 bp DNA-Ladder). Niet te veel de gel (1 µg DNA per putje). Gels in passende 1 x TRIS-boraat-EDTA (FSME) lopende buffer bij 150 V (constante) uitgevoerd voor rond 1,5 h of tot de lagere kleurstof voorkant (bromophenol blauw, donker blauwe kleur) die worden uitgewisseld op ongeveer 15 bp, bereikt het onderste uiteinde van de gel. De gel met een uiterst gevoelige nucleïnezuur vlek vlek en visualiseer onder UV-licht. Bepaal de optimale concentratie van MNase voor verteren DNA tot 20-30 bp in grootte van het beeld van de gel. Gebruik de geoptimaliseerde concentratie van MNase om te verteren doelDNA herhaalt u stappen 1.2-2.2. Meestal, verteerd opzetten van 10-12 Reacties (d.w.z. 10-12 µg voor totaal grondstof) genoeg levert DNA na pagina gel extractie om naar de volgende stappen te gaan. Met een steriel scalpel, snijd de gel naast de marker lane en alleen het gedeelte van de gel met de ladder met vers 1 x TBE lopende buffer met 1 X van een ultra gevoelige nucleïnezuur vlek vlek. Visualiseren van de DNA-ladder en accijnzen MNase-verteerd DNA-fragmenten in de groottewaaier tussen ongeveer 18-30 bp met behulp van een scheermesje.Opmerking: Vermijd blootstelling van de MNase verteerd fragmenten aan UV-licht. Het is mogelijk te gebruiken van een blauwe lichtbron (in plaats van UV) of neem een foto van de ladder onder UV-licht, afdrukken te schalen en gebruik dit als leidraad excisie van MNase-verteerd DNA-fragmenten). Deze stap vermijdt kleuring en blootstelling van DNA-fragmenten aan UV-licht. Gebruik altijd een ongebruikte, steriele wegwerp scalpel of scheermesje voor deze stap om verontreiniging te voorkomen. Het gel-segment overbrengen in een microcentrifuge buis. Vlekken van de rest van de gel met nucleïnezuur vlek als boven, blootstellen aan UV-licht en het opnemen van een afbeelding om een register bijhouden van de gel excisie stap. 3. isolatie van DNA-fragmenten van pagina-gelen Crush en Soak methode gebruiken Opmerking: Deze stap is overgenomen van Sambrook et al. 11 Bereiden pagina gel solubilisatie buffer (1,88 mL 4 M ammoniumacetaat, 150 µL van 1 M magnesium acetaat en 30 µL 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (pH 8) in ultrazuiver H2O tot een totaal volume van 15 mL). Plet het segment van de verwijderde gel tegen de muur van de micro-centrifuge buis met behulp van een steriele pipette uiteinde. Voeg 2 solubilisatie paginabuffer hoeveelheid gel en Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur op een draaiend platform. Centrifugeer de monsters voor 1 min op maximale snelheid in een microcentrifuge. Het supernatant overbrengen in een nieuwe microcentrifuge-buis, zorg om niet over te brengen van alle stukken gebroken gel. Voeg toe 0,5 volumes van de buffer van de solubilisatie van de pagina aan de gel pellet, vortex, en herhaal het centrifugeren (stap 3.4). Combineer het supernatant. Pak de DNA-fragmenten met behulp van standaard fenol-chloroform extractie.Let op: Fenol is giftig als het komt in contact met de huid of inslikken. Voorzorgsmaatregelen betreffende veiligheid zoals handschoenen, beschermende brillen, een laboratoriumjas, en het werken in een zuurkast staan kritisch tegenover. Verwijdering van alle fenol-bevattende afval volgens de reglementen van het Instituut. Voeg één volume van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) aan het monster en de vortex grondig. Centrifugeer gedurende 10 minuten op maximale snelheid (16.000 x g) in een tafelblad centrifuge bij kamertemperatuur. Zorgvuldig overbrengen in de bovenste waterfase een verse microcentrifuge buis. Wees voorzichtig niet te voeren over fenol tijdens pipetteren. Herhaal stap 3.6.1 en 3.6.2 eens. Voeg een kleine hoeveelheid (0.2 µL) glycogeen, 0.1 volumes van 3 M Natriumacetaat (pH 5.2) en 2 volumes van 100% ethanol (EtOH). Vortex en Incubeer bij-20 ° C gedurende enkele uren of ‘s nachts. Centrifugeer gedurende 30 minuten op maximale snelheid bij 4 ° C met behulp van een tafelblad centrifuge. Verwijder voorzichtig het supernatant en het wassen van de DNA-pellet met 70% EtOH. Centrifugeer gedurende 30 minuten op maximale snelheid bij 4 ° C met behulp van een tafelblad centrifuge. Verwijder het supernatant en drogen van de DNA-pellet. Zorg ervoor dat alle de EtOH is verdampt, maar wees voorzichtig niet te overdreven drogen de pellet. Ontbinden van DNA pellet in 12 µL van H2O.Opmerking: Pagina gel extractie is zeer inefficiënt. Voor elke 10 µg DNA verteerd met MNase beginnen, verwachten om te herstellen van de ng 1-20 van gezuiverde fragmenten na extractie van de gel. Bedrag en de integriteit van fragmenten besturen door het laden van 1/6th (2 µL) op een pagina gel (figuur 2C). 4. einde reparatie van MNase-verteerd, Gel-gezuiverd fragmenten De volgende reactie gebruikend een DNA afstomping kit instellen: 10 µL van gezuiverde DNA uit stap 3.6.10, 1.5 µL van 10 X afstomping buffer 1.5 µL van 1 mM dNTP mix, 0.6 µL van stompen enzym, 1.4 µL van H2O. Incubeer bij 22 ° C gedurende 30 minuten en vervolgens hitte-inactivering van het enzym door incubatie bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Voeg 85 µL van H2O en uitvoeren van een reactie-opschonen met behulp van standaard fenol/chloroform-extractie en EtOH-neerslag (zoals beschreven in punt 3.6). Ga direct naar linker afbinding. 5. de linker generatie Opmerking: Linkers moeten worden versterkt, parallel met sectie 3 te kunnen onmiddellijk over te gaan met linker afbinding. Primer sequenties gebruikt onder moet geschikt zijn voor de gekozen gRNA expressie vector. Die hier worden beschreven zijn ontworpen voor de vector pgRNA-pLKO.1. 9 voor versterking van de linker 5′ van pgRNA-pLKO.1, gebruik de primer sequenties 5′-linker-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) en 5′-linker-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), een 689 bp amplicon oplevert. Voor versterking van de linker 3′ van pgRNA-pLKO.1, gebruik de inleidingen 3′-linker-F: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) en de 3′-linker-R: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), die een 848 bp amplicon opleveren. PCR-versterken de adapter sequenties van de gRNA expressie vector (met behulp van reagentia van keuze en aangepaste primer sequenties, indien nodig). Voor pgRNA-pLKO.1 instellen op de volgende 50 µL PCR reactie: 25 µL van het PCR master mix, 2.5 µL primer F (10 µM), 2,5 µL primer R (10 µM), 0.1 ng van gRNA expressie vector (pgRNA-pLKO.1) in H2O. Incubeer reacties op een thermocycler met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus 98 ° C gedurende 30 s, 32 cycli 98 ° C voor 10 s, 59 ° C gedurende 10 s, 72 ° C gedurende 30 s, 1 cyclus 72 ° C gedurende 10 minuten. Zuiveren van PCR reacties met behulp van de vaste fase omkeerbare immobilisatie kralen volgens de instructies van de fabrikant. Elueer in 30 µL van H2O. Om af te dwingen directionele Afbinding van de linker naar de einde-gerepareerd, MNase-verteerd DNA-fragmenten, digest linkers met geschikte restrictie-enzymen (hier HindIII en SacII). Instellen van de volgende reacties: Gebruik voor de vertering van 5′ linker met HindIII, 30 µL van gezuiverde 5′ linker amplicon uit stap 5.3., 5 µL van Buffer, 3 µL van HindIII (20U/µL) en 12 µL van H2O. Gebruik voor de vertering van 3′ linker met SacII, 30 µL van gezuiverde 3′ linker amplicon uit stap 5.3., 5 µL van Buffer, 3 µL van SacII (20 U/µL), en 12 µL van H2O. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur geklaard. Toevoegen van DNA-gel laden kleurstof en uitvoeren van het beperkingsenzym verteert op een 1% agarose gel. Accijnzen van de bands op 637 bp (linker digest 5′) en 295 bp (linker digest 3′). Het zuiveren van het DNA van de stukken van de verwijderde gel met behulp van een gel extractie kit. 6. de linker afbinding en versterking van Inserts Instellen van een 14 µL afbinding reactie mengsel hoeveelheden van MNase-verteerd, einde herstelde fragmenten en linker sequenties gebruikt.Opmerking: Linker fragment verhouding kan worden geoptimaliseerd. Het is aanbevolen om een neen-fragment controle (NFC) reactie omvatten. Gebruik 5 ng van MNase-verteerd fragmenten (einde-gerepareerd en gezuiverd), 120 ng voor 5′ linker (HindIII digest, gezuiverd), 55 ng 3′ linker (SacII digest, gezuiverd), 1.4 µL van T4 ligase Buffer en 1.4 µL van geconcentreerde T4 DNA ligase in H2O. Incubeer de afbinding reacties bij 16 ° C voor 16 h. Doen niet warmte-inactivering van het enzym. Onmiddellijk gaan nick-vertaling.Opmerking: De einde-gerepareerd MNase-verteerd fragmenten bieden de fosfaten 5′ noodzakelijk voor afbinding van linkers, als de linker zelf zijn VN-gefosforyleerd. Aan de afbinding reactie (en de reactie van NFC) Voeg het volgende toe: 25 µL van Taq 2 X master mix (capable van nick vertaling), 2,5 µL primer Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2,5 µL primer Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) en 6 µL van H2O. Een besturingselement voor het neen-template (NTC) bevatten. Incubeer reacties op een thermocycler met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus (nick vertaling): 72 ° C gedurende 20 minuten, 1 cyclus: 95 ° C gedurende 5 minuten, 3-4 cycli: 95 ° C gedurende 15 s, 58 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 30 s, 1 cyclus: 72 ° C gedurende 5 minuten. Voer een reactie-opschonen vaste fase omkeerbare immobilisatie kralen met een monster te kraal verhouding van 1:1. Elueer in 40 µL van H2O. Verder versterken van het gewenste fragment (5′ linker + MNase + 3 fragment’ linker) met behulp van passende PCR Reagentia en de volgende inleidingen: Gebruik van 12,5 µL van het PCR master mix, 1,25 µL primer Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1,25 µL primer Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 2,5 µL van gezuiverde nick vertaling product uit stap 6.4. en 7,5 µL van H2O. gebruiken de volgende voorwaarden: 1 cyclus: 98 ° C gedurende 30 s, 10-16 cycli: 98 ° C gedurende 10 s, 63 ° C gedurende 10 s, 72 ° C gedurende 15 s, 1 cyclus: 72 ° C gedurende 10 minuten.Opmerking: Indien nodig, meerdere reacties kunnen worden instellen in parallel om ervoor te zorgen dat er genoeg PCR product voor opeenvolgende stappen. Om te visualiseren van kleine hoeveelheden van het PCR-product op een agarose gel, instellen van extra reacties zoals in stap 6.5 en verhoog de waarde van de cyclus van 15 tot en met 32. Deze reactie kan worden gebruikt als kwaliteitscontrole, als waarbij na 15 cycli niet zichtbaar zijn. Zijn ook een geen sjabloon controle (NTC). 7. maat keuze Opmerking: Deze stap scheidt MNase-fragmenten met het correct aangesloten 5′ en 3′ linker fragmenten met twee 5′ of twee 3′ linkers op basis van grootte. Combineren van alle 15-cyclus PCR reacties uit stap 6.5. DNA laden kleurstof toevoegen en op een 0,8% agarose gel in werking. De prominente band op 869 accijnzen bp en te zuiveren van DNA met behulp van een gel extractie kit. De hoeveelheid DNA (bijvoorbeeld gebruik van een spectrofotometer) te kwantificeren. 8. klonen van PCR-versterkte fragmenten in de gRNA expressie Vector door Gibson vergadering Voorbereiding van de vergadering meester mix als volgt:Opmerking: De volgende stappen zijn aangepast van Gibson et al. 12. 6 mL isothermische reactie buffer te maken door het combineren van 3 mL 1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-HCl pH 7.5, 300 µL van 1 M MgCl 60 µL van 100 mM deoxyguanosine trifosfaat (dGTP), 60 µL van 100 mM deoxyadenosine trifosfaat (dATP), 60 µL van 100 mM deoxythymidine adenosinetrifosfaat (dTTP), 60 µL van 100 mM deoxycytidine trifosfaat (dCTP), 300 µL van 1 M dithiothreitol (DTT), 1.5 g van polyethyleenglycol (PEG)-8000, 300 µL van 100 mM nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) in ultrazuiver H2O.Opmerking: Deze buffer kan worden aliquoted en opgeslagen bij-20 ° C. 1.2 mL vergadering master mix maken door het combineren van 320 µL van 5 X isothermische reactie buffer, 3 µL van 10 U/µL T5 exonuclease, 20 µL van 2 U/µL van DNA Taq, 160 µL van 40 U/µL DNA ligase in ultrazuiver H2O. gebruik 15 µL van vergadering master mix met 5 µL van invoegen.Opmerking: De vergadering master mix kan worden aliquoted en opgeslagen bij-20 ° C, waar het is stabiel voor meer dan een jaar en meerdere bevriezen-ontdooien cycli kan tolereren. Het gekozen bedrag van T5 exonuclease is ideaal voor gebruik met lange overhangen. Vector ruggengraat spijsverteringOpmerking: Zorg ervoor dat een voldoende hoeveelheid van de vector als input voor het gewenste aantal vergadering reacties in stap 8.3 verteren. Per reactie, voeg het volgende toe: 1,5 µg gRNA expressie vector (pgRNA-pLKO.1), 5 µL van buffer, 1.5 µL van leeftijdik (5U/µL) en 38.5 µL van H2O. Incubate verteren bij 37 ° C gedurende 2 uur. Defosforylerings van de gelineariseerde vector.Opmerking: Deze stap is geadviseerd, maar niet strikt noodzakelijk. T5 exonuclease in de master mix wordt meestal verwijderd de leeftijdik overhangt voordat de polymerase van DNA-ligase heeft een kans om op te treden. Buitensporige opnieuw Afbinding van de vector is daarom niet te verwachten. Voeg 2.5 µL van garnalen alkalische fosfatase-enzym (rSAP, 1 U/µL). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, en vervolgens de inactivering van het enzym door broeden bij 65 ° C gedurende 5 min. Uitvoeren van DNA zuiveringOpmerking: Het wordt aanbevolen een agarose gel extractie stap moet uitvoeren. Kolom- of kraal zuivering kan als alternatief worden gebruikt. Het is belangrijk om te controleren dat de vector vertering voltooid, bijvoorbeeld door agarose gelelektroforese is. Ter vergelijking, moet onverteerd vector parallel worden uitgevoerd. Kwantificeren van het bedrag van de gezuiverde verteerd vector in de steekproef. De vergadering met 2-fold molaire overmaat van tussenvoegsels instellen op vector. Per 20 µL reactie gebruik 100 ng van vector (leeftijdik uit stap 8.5 verteren), 12.2 ng van invoegen (uit stap 7.1.), 15 µL van vergadering master mix uit stap 8.1.2. in H2O. Incubeer bij 50 ° C gedurende 1 uur. Zuiveren van de reacties met behulp van kolom zuivering. Resuspendeer de DNA in 75 µL van H2O (of volume afhankelijk van omvang van electroporation nodig).Opmerking: De efficiëntie van de transformatie is sterk afhankelijk van de zuiverheid van het DNA. Extra zuivering stappen (bijv . fenol/chloroform extractie) kunnen de efficiëntie verbeteren. 9. voorbereiding van Electro-bevoegde TG1 E. coli cellen Ervoor zorgen dat alle Centrifugeer flessen en flacons vrij van detergentia door spoelen en latere vullen met gedestilleerd water voordat autoclaaf zijn.Opmerking: Deze stap helpt te verwijderen alle onzuiverheden die invloed kunnen hebben op de efficiëntie van de transformatie. Water moet direct vóór gebruik worden weggegooid. Als alternatief misschien gebruik van wegwerp centrifugeren flessen wel aan te raden. Zorg ervoor dat de centrifuge flessen, buizen en oplossingen gebruikt voor de bereiding van electrocompetent cellen zijn gekoeld op ijs vóór gebruik. Het is het beste om te voeren de volgende stappen uit in een koude kamer om te minimaliseren van temperatuurschommelingen die invloed kunnen hebben op de efficiëntie van de transformatie. 2TY medium voor te bereiden. Met 16 g bacto trypton toevoegen 10 g gistextract en 5 g NaCl, aan 1 L, mix en autoclaaf gedestilleerd water. Opslag medium bij kamertemperatuur. 2TY-agar gecoat bioassay gerechten en 10 cm petrischalen met het juiste antibioticum voorbereiden. Winkel platen bij 4 ° C.Opmerking: De keuze van het antibioticum is afhankelijk van de aard van de gRNA expressie vector, gebruik 100 µg/mL ampicilline voor pgRNA-pLKO.1. Schraap uit een voorraad van glycerol TG1 cellen om te enten 10 mL 2TY medium (zonder antibiotica). Incubeer cultuur bij 37 ° C’s nachts (~ 16 h) met schudden bij 225 t/min. 1 L 2TY medium (zonder antibiotica) met de nachtelijke cultuur (in de verdunning 1/100) 10 mL beënten en verdeel het even tussen twee 2 L kolven (met baffles). Incubeer bij 37 ° C, 225 rpm tot een OD600 nm 0,55 is bereikt (ongeveer na 1,5-2 h) cultuur. Het gebruik van een spectrofotometer OD600 nm om regelmatig te controleren. Chill culturen op het ijs gedurende 30 minuten. Splitsen de cultuur even tussen vier 500 mL centrifuge flessen (vooraf gekoeld op ijs). Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4000 x g bij 4 ° C in een vooraf gekoeld centrifuge. Decanteren supernatant en 1 deel (d.w.z. 250 mL) vooraf gekoeld ijskoude steriel gedistilleerd H2O toevoegen aan elk van de centrifuge flessen. Resuspendeer de pellet van bacteriële door zwenken of omkeren van de fles (of door het zachte pipetteren, indien nodig).Opmerking: Het is gemakkelijker om resuspendeer de pellet door eerst een kleine hoeveelheid water toe te voegen. De pellet is volledig geresuspendeerde uiteindelijk zorgen. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4000 x g bij 4 ° C. Herhaal de wash twee keer (stappen 9.12. en 9.13). Verwijder het supernatant. Wees voorzichtig met het decanteren naarmate de bacteriële pellet steeds los na het wassen. Resuspendeer de pellet in 50 mL steriele, ijskoude 10% glycerol en overbrengen naar een centrifugebuis pre gekoeld 50 mL. Centrifuge cellen gedurende 15 minuten staan bij ~ 4000 x g bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig het supernatant. Zachtjes resuspendeer de bacteriën in 2 mL ijskoud steriele 10% glycerol. Houd op ijs als de cellen moeten onmiddellijk worden gebruikt voor electroporation.Opmerking: De cellen kunnen worden bevroren in porties van 50 µL in 0,5 mL buizen in een bad van droogijs ethanol en opgeslagen bij-80 ° C, maar dit wordt niet aanbevolen. 10. Electroporation TG1 Electrocompetent E. coli cellen Opmerking: Electroporation is een van de knelpunten in de generatie van de uitgebreide bibliotheek. Voor het behoud van de vertegenwoordiging van de bibliotheek, is het raadzaam te voeren zoveel individuele electroporation reacties zo nodig/mogelijk is en de kwaliteitscontrole stappen hieronder beschreven (10.6. en 10.8.). Aliquot de gezuiverde Reacties (uit stap 8.8) in vooraf gekoeld en steriele PCR buizen en houd ze op het ijs (1 µL per buis). Chill 1 mm gat electroporation cuvettes op ijs. 25 µL van vers bereide TG1 cellen rechtstreeks toevoegen aan een aliquoot gedeelte van het DNA en onmiddellijk overdracht het mengsel in een cuvet electroporation. Flick of tik op de meetcel zodat de cellen/DNA mix wordt verspreid langs de lengte van de kamer van de Cuvet (zonder ingesloten lucht of bellen). Plaats de cuvette in de zaal van de dia en start het juiste electroporation programma (bv. 1 impuls voor 1.8 kV (EG1)).Opmerking: De tijdconstante moet liggen tussen 5.7 en 6.0 ms. Ingeval de electroporator bogen, flick de cuvette, te verzekeren dat er geen luchtbellen in de zaal en probeer het opnieuw. Onmiddellijk 975 µL van kamertemperatuur 2TY medium aan de cuvette toevoegen. Met behulp van een pipet overdracht, verplaats de electroporated bacteriën naar een tube van 50 mL. Herhaal vanaf stap 10.2. en het verzamelen van alle cellen getransformeerd met een bibliotheek in een tube van 50 mL. Het document van het totale volume. Kwaliteitscontrole stap Uitvoeren om te kwantificeren van de bevoegdheid van de vers gegenereerde electro-bevoegde cellen, een aparte electroporation reactie met behulp van een bepaalde hoeveelheid Onbesneden plasmide DNA (bijvoorbeeld 10 pg pUC19 controle plasmide). Dit overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis.Opmerking: De bevoegdheid moet ten minste 1010 kolonie-vormende eenheden (kve per µg DNA). Vers bereide cellen presteren meestal beter dan dit. Incubeer getransformeerde bacteriën bij 37 ° C gedurende 60 minuten schudden bij 225 t/min. Kwaliteitscontrole stap: Plaat een gedefinieerde kleine hoeveelheid bacteriën omgezet met de bibliotheek (bijvoorbeeld 10 µL van een 10-100 vouw verdunning) op een 10 cm agarplaat met de juiste antibiotica keuze.Opmerking: Weten het totale cultuur volume (uit stap 10.6.), kan het aantal verkregen kolonie te schatten van het totale aantal kolonies voor de gehele bibliotheek worden gebruikt. 20-30 vouw vertegenwoordiging van de bibliotheek moet idealiter worden gehandhaafd. De rest van de bacteriën op 2TY agar gecoat bioassay gerechten met de juiste antibiotica selectie verspreiden.Opmerking: Het volume van de cultuur kan worden verminderd door middel van centrifugeren op ~ 4000 x g gedurende 10 minuten (of totdat een zichtbaar pellet heeft gevormd en het supernatant wordt duidelijk weergegeven). Dit vermindert de tijd platen droog moeten na verspreiding van de cultuur. Gebruik van platen in plaats van vloeibare cultuur minimaliseert buitensporige groei van afzonderlijke kolonies. 13 Het verspreiden van een passende omvang van de pUC19 controle electroporation reactie op een extra 10 cm agar schotel met de juiste antibiotica keuze. Incubeer agar platen ‘s nachts (16 h) bij 37 ° C. Tellen verkregen kolonies op de platen van de controle (pUC19 en controle bibliotheek plaat) te schatten CFU/µg DNA voor de bacteriën en de complexiteit van de bibliotheek. 11. extractie van DNA plasmide Voeg 10 mL van 2-TY media aan de nachtelijke platen, schraap de bacteriële laag uit de plaat met behulp van een wegwerp strooier en verzamelen in een tube van 50 mL. Herhaal een paar keer totdat alle van de plaat wordt weergegeven schoon. Uittreksel DNA met behulp van een plasmide Maxi kit (2-3 kolommen nodig per biotoetsen plaat).