Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

1. sindirim Micrococcal nükleaz ile DNA’ın Bir en iyi duruma getirme reaksiyon micrococcal nükleaz enzim (MNase) yeni her toplu işlem için gerçekleştirin.Not: MNase kullanılan birim sayısını ( şekil 2Abir seri dilüsyonu kullanılarak) test edilmelidir. Genellikle, 5-10 MNase U sindirmek, 1 µg genomik saf veya BAC DNA 5-100 bp koşulları ile bir dizi aşağı aşağıda açıklanmıştır. Reaksiyon 10 MNase arabellek x, 1 sığır serum albumin (BSA), DNA, MNase 1 µL hedefinin 1 µg x 1 µL ayarlayın (0,1-50 adet) 10 µL tepki birimindeki. 15 dakika 37 ° C’de kuluçkaya. Hemen enzim 500 mm etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N 1 µL ekleyerek devre dışı bırakın ‘, N’-tetraacetic asit (EGTA). 2. DNA ayrılması Polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) kullanarak parçaları Örnek arabellek/jel boya DNA örnekleri için yükleme ekleyin ve % 20 sayfa jel yük. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yük (5 bp DNA merdiven). Jel (1 µg DNA iyi başına) aşırı değil. Bp, 1,5 s çevresinde veya 15 civarında seyahat alt boya açık (bromophenol mavi, koyu mavi renk) kadar ulaştığı için jel alt sonuna jelleri uygun 1 x TRIS-Bor-EDTA (TBE) çalışan arabellekte 150 V (Sabit) çalıştırın. Bir ultra-duyarlı nükleik asit leke kullanarak jel leke ve UV ışığı altında görselleştirin. Jel görüntüden MNase optimum konsantrasyonu boyutu 20-30 kan basıncı aşağı sindirim DNA’ın belirlemek. MNase en iyi duruma getirilmiş konsantrasyonu adımları 1.2-2.2 tekrar ederek hedef DNA sindirmek için kullanın. Genellikle, 10-12 kadar reaksiyonlar (Yani 10-12 toplam malzeme başlayan µg) yeterli verim ayarlama sonraki adımlarına devam etmek için DNA sayfa jel ayıklama takip sindirilir. Steril neşter kullanarak, jel marker lane yanında kesmek ve sadece merdiven içeren 1 X bir ultra-duyarlı nükleik asit leke taze 1 x TBE çalışan ile tampon içeren jel parçası leke. DNA merdiven görselleştirmek ve MNase sindirilmiş DNA parçalarının yaklaşık 18-30 kan basıncı jilet kullanarak arasında boyut aralığındaki tüketim.Not: MNase sindirilmiş parçaları UV ışık için kullanılmasını önlemek. Bu mavi bir ışık kaynağı (UV) yerine kullanın veya UV altında merdivenin fotoðraf, ölçeği ve eksizyon MNase sindirilmiş DNA parçalarının kılavuzunu kullanma bu yazıcıya yazdırma mümkündür). Bu adımı boyama ve DNA parçalarının ışığa maruz kalma UV önler. Her zaman bir kullanılmayan, steril tek kullanımlık bistüri veya jilet için bu adımı kirlenmesini önlemek için kullanın. Microcentrifuge tüp jel dilim aktarın. Jel geri kalanı ile nükleik asit leke leke, UV ışığına maruz ve jel eksizyon adım bir kaydını tutmak için bir görüntü kaydetmek. 3. sayfa-jelleri Crush ve emmek yöntemi kullanarak gelen DNA parçalarının yalıtım Not: Bu adımı Sambrook et al. kabul edilmiştir 11 Sayfa jel solubilization arabellek (4 M amonyum asetat, 150 µL 1 M magnezyum asetat, 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (pH 8) ultrasaf H2O 15 mL toplam hacmiyle 30 µL 1.88 mL) hazırlayın. Steril pipet ucu kullanarak mikro-santrifüj tüpü duvara eksize jel dilim ezmek. 2 sayfa solubilization arabellek hacimleri jel ve dönen bir platform üzerinde 16 h için 37 ° C’de kuluçkaya ekleyin. Örnekleri için bir microcentrifuge maksimum hızda 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant herhangi bir ezilmiş jel adet aktarmak için dikkat çekici bir yeni microcentrifuge tüp için transfer. 0,5 eklemek sayfa solubilization arabelleğe jel hacimleri cips, girdap ve (Adım 3.4) aralıklarla tekrarlayın. Supernatants birleştirmek. Standart fenol kloroform ayıklama kullanarak DNA parçaları ayıklayın.Dikkat: Fenol deri ile temas gelirse ya da yutulması halinde toksiktir. Güvenlik önlemleri eldiven, koruyucu gözlük, önlük ve duman mahallede çalışma gibi kritik öneme sahiptir. Enstitü nün düzenlemelere göre tüm fenol içeren atık imha. Fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1) bir birim örnek ve girdap iyice ekleyin. Santrifüj 10 dk içinde oda sıcaklığında masa üstü bir santrifüj maksimum hızda (16.000 x g) için. Dikkatle üst sulu faz taze microcentrifuge tüp aktarın. Üzerinde herhangi bir fenol pipetting sırasında taşımak için değil, kendine iyi bak. 3.6.1 ve bir kez 3.6.2 adımları yineleyin. Az miktarda glikojen, 3 M sodyum asetat (pH 5.2) 0.1 birimleri (0.2 µL) ekleyin ve % 100 etanol (alkol) 2 cilt. Girdap ve birkaç saat için-20 ° C’de kuluçkaya veya bir gece. Masa üstü bir santrifüj kullanarak 4 ° C’de maksimum hızda 30 dk santrifüj. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve DNA Pelet % 70 ile yıkayın alkol. Masa üstü bir santrifüj kullanarak 4 ° C’de maksimum hızda 30 dk santrifüj. DNA Pelet kurumasına ve süpernatant çıkarın. Tüm alkol buharlaşıp vardır emin olun ama Pelet aşırı kuru değil dikkatli olun. DNA Pelet H2o 12 µL içinde erimesiNot: Sayfa jel ayıklama çok verimli değildir. 1-20 ng arıtılmış parçalarının jel çıkarma sonra kurtarmak DNA ile MNase sindirilmiş başlayan her 10 µg için bekliyoruz. Denetim tutar ve parçaları bütünlüğünü 1/6inci yükleyerek (2 µL) üzerinde bir sayfa jel (şekil 2C). 4. son MNase sindirilmiş, jel saf parçaları tamiri Kit blunting bir DNA’yı kullanarak aşağıdaki tepki kadar ayarla: Adım 3.6.10, 10 blunting tampon, 1 mM dNTP Mix 1,5 µL, 0.6 µL azalmanın enzim, H2O. 1.4 µL X 1,5 µL saf DNA’ın 10 µL 30 dk 22 ° C’de kuluçkaya ve sonra ısı-enzim kuluçka 10 dk 70 ° C’de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz. H2O 85 µL ekleyin ve bir reaksiyon standart fenol/kloroform-ekstraksiyon ve alkol-yağış (3.6 bölümünde anlatıldığı gibi) kullanarak temizlik yapmak. Derhal bağlayıcı ligasyonu için gidin. 5. bağlayıcı üretimi Not: Bölüm 3 hemen bağlayıcı ligasyonu ile devam edebilmek için paralel olarak kuvvetlendirilmesine halkalı gerekir. Aşağıda kullanılan astar dizileri seçilen gRNA ifade vektör için uygun olmalıdır. Bu burada sunulan vektör pgRNA-pLKO.1 için tasarlanmıştır. 9 astar dizileri 5′-bağlayıcı-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) ve 5′-bağlayıcı-689 bp amplicon verimli R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), pgRNA-pLKO.1 üzerinden 5′ bağlayıcı amplifikasyon için kullanın. PgRNA-pLKO.1 üzerinden 3′ bağlayıcı amplifikasyon için astar 3′-bağlayıcı-F: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) ve 3′-bağlayıcı-R: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), hangi bir 848 bp amplicon verim kullanın. PCR yükseltmek (gerekirse seçim ve özel astar sahneleri, reaktifler kullanarak) gRNA ifade öğesinden bağdaştırıcı diziler. PgRNA-pLKO.1 aşağıdaki 50 µL PCR tepki kadar ayarlamak için: 25 µL PCR ana mix, astar F 2.5 µL (10 µM), 2,5 µL astar R (10 µM), 0.1 ng gRNA ifade vektör (pgRNA-pLKO.1) H2O. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler reaksiyonlar kuluçkaya: 1 geçiş yapmak için 30 98 ° C s, 32 devredir 98 ° C 10 s, 10 59 ° C s, 30 72 ° C s, 1 çevriminde 72 ° C 10 dak. Katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk üretici yönergelerine göre kullanarak PCR reaksiyonları arındırmak. H2o 30 µL içinde elute Sonunda tamir, MNase sindirilmiş DNA parçalarının bağlayıcıya, Özet bağlayıcı uygun (burada HindIII ve SacII) enzimleri ile yön ligasyonu zorlamak için. Aşağıdaki reaksiyonlar ayarlayın: 5′ bağlayıcı HindIII ile sindirim için saflaştırılmış 5′ bağlayıcı amplicon adım 5.3 30 µL kullanın., 5 µL arabellek, HindIII (20U/µL) 3 µL ve H2o 12 µL 3′ bağlayıcı SacII ile sindirim için saflaştırılmış 3′ bağlayıcı amplicon adım 5.3 30 µL kullanın., 5 µL arabelleği, SacII 3 µL (20 U/µL) ve H2o 12 µL 3 h için 37 ° C’de digests kuluçkaya. DNA jel boya yükleme ekleyin ve restriksiyon enzimi özetler bir % 1’özel jel çalıştırın. 637, bantları tüketim bp (5′ bağlayıcı Özet) ve 295 bp (3′ bağlayıcı Özet). Bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak eksize jel adet DNA’dan arındırmak. 6. bağlayıcı ligasyonu ve ekler amplifikasyon MNase sindirilmiş, sonunda tamir parçaları ve bağlayıcı sıraları ekimolar miktarda kullanarak 14 µL ligasyonu tepki kadar ayarla.Not: Bağlayıcı parçası oranları için optimize edilmiş olması. Bu bir Hayır-fragment denetim (NFC) tepki eklemek önerilir. (Son tamir ve saf) MNase sindirilmiş parçaları, 120 kullanım 5 ng ng 5′ bağlayıcı (safHindIII Özet,), 55 ng 3′ bağlayıcı (SacII Özet, saf), T4 ligaz arabellek 1.4 µL ve konsantre T4 DNA ligaz H2O. 1.4 µL Tüp ligasyonu reaksiyonlar için 16 h 16 ° C’de kuluçkaya. Yapmak değil enzim ısı devre dışı. Derhal nick-çeviri için gidin.Not: Sonunda tamir MNase sindirilmiş parçaları fosfatlar 5′ gerekli sağlamak için ligasyonu halkalı, bağlayıcı kendileri un fosforile olan. İçin ligasyonu reaksiyon (ve NFC reaksiyon) aşağıdakileri ekleyin: Taq 2 25 µL ana mix (nick tercümesi kabil) X, 2.5 µL astar bağlayıcı-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2,5 µL astar bağlayıcı-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) ve 6 µL H2O. Bir no-şablonu denetimi (NTC) içerir. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler reaksiyonlar kuluçkaya: 1 döngüsü (nick çeviri): 72 ° C 20 dk, 1 döngüsü için: 95 ° C 5 dk, 3-4 döngüleri için: 15 95 ° C s, 15 58 ° C s, 30 72 ° C s, 1 döngüsü: 72 ° C 5 min için. Bir reaksiyon katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk boncuk oranı 1:1 bir örnek ile kullanarak temizlik gerçekleştirin. H2o 40 µL içinde elute Daha da yükseltmek istediğiniz parça (5′ bağlayıcı + MNase + 3 parçası ‘ bağlayıcı) aşağıdaki astar ve uygun PCR reaktifler kullanarak: 12.5 µL PCR ana mix, astar bağlayıcı-Minus450-F 1,25 µL kullanın (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1,25 µL astar bağlayıcı-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), saflaştırılmış nick çeviri ürün–dan adım 6.4 2.5 µL. ve H2O. 7.5 µL kullanın aşağıdaki koşullar: 1 döngüsü: 30 98 ° C s, 10-16 döngüleri: 10 98 ° C s, 10 63 ° C s, 72 ° C 15 s, 1 döngüsü: 72 ° C 10 dk için.Not: gerekirse, çeşitli tepkiler paralel olarak sonraki adımlar için yeterli PCR ürünü sağlamak için ayarlanabilir. PCR ürünü az miktarda bir özel jel üzerinde görselleştirmek için 32 15 döngü sayısını artırmak ve adım 6.5 gibi ek reaksiyonlar ayarlayın. Amplicons 15 döngüsünden sonra görünür değilse bu reaksiyon kalite kontrol kullanılabilir. Ayrıca bir şablonu kontrol (NTC) içerir. 7. Boyut seçimi Not: Bu adımı MNase parçaları doğru ekli 5′ ve 3′ bağlayıcı ile parçaları iki kenarından ayıran 5′ veya iki 3′ halkalı boyutuna göre. Tüm 15-döngüsü PCR reaksiyonları adım 6.5 birleştirmek., boya yükleme DNA ekleyin ve üzerinde % 0,8 özel jel çalıştırın. Önemli grup 869, tüketim bp ve bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA arındırmak. (Bir Spektrofotometre kullanarakörneğin ) DNA miktarını ölçmek. 8. klonlama gRNA Gibson derleme tarafından ifade vektör içine PCR güçlendirilmiş parçalarının Derleme hazırlamak mix aşağıdaki gibi usta:Not: Aşağıdaki adımları Gibson ve ark. adapte olmuşlardır 12. 1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 3 mL birleştirerek 6 mL izotermal tepki arabelleği oluşturmak-HCl pH 7.5, 1 M MgCl, 60 µL 100 mM deoxyguanosine trifosfat (dGTP), 100 mM deoxyadenosine trifosfat (dATP) 60 µL, 100 mM deoxythymidine 60 µL 300 µL trifosfat (dTTP), 100 mM deoxycytidine trifosfat (dCTP), 1 M dithiothreitol (DTT), polietilen glikol (PEG)-8000, 100 mM Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD) ultrasaf H2o 300 µL 1.5 g 300 µL 60 µLNot: Bu arabellek bölünmemeli ve -20 ° C’de depolanmış olabilir 320 µL izotermal tepki arabellek X 5, 10 U/µL T5 eksonükleaz aktivitesi, 2 U/µL DNA polimeraz, derleme ana karışımı ile 5 µL ultrasaf H2O. kullanım 15 µL 40 U/µL DNA ligaz 160 µL 20 µL 3 µL birleştirerek 1.2 mL derleme ana karışımı oluşturmak yerleştirin.Not: Derleme ana mix bölünmemeli ve saklı-20 ° C’de nerede fazla bir yıl için kararlı olduğunu ve birden çok donma-çözülme çevrimleri tolere edebilir. T5 eksonükleaz seçilen miktarı uzun çıkıntılar ile kullanmak için idealdir. Vektör omurga sindirimNot: derleme reaksiyonlar 8.3 adımda istediğiniz sayıyı için giriş olarak vektör yeterli miktarda sindirimi emin olun. Aşağıdaki reaksiyon ekleyin: ı (5U/µL) ve 38.5 µL H2O. Incubate gRNA ifade vektör (pgRNA-pLKO.1), 5 µL arabelleği, yaş1,5 µL 1,5 µg sindirmek için 2 h 37 ° C’de. Doğrusallaştırılmış vektör dephosphorylation.Not: Bu tavsiye, ama kesinlikle gerekli bir adımdır. T5 eksonükleaz ana karışımında çoğunlukla yaşkaldırmak Taq DNA ligaz hareket etmeye fırsat bulamadan çıkıntılar. Bu nedenle, aşırı yeniden ligasyonu Yöneyin beklenmiyor. Karides alkalen fosfataz enzim (rSAP, 1 U/µL) 2.5 µL ekleyin. 30 dk 37 ° C’de kuluçkaya ve enzim 65 ° c 5 min için kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz. DNA arıtma gerçekleştirmekNot: Bu bir özel jel ayıklama adımı gerçekleştirmeniz önerilir. Alternatif olarak, sütun veya boncuk arıtma-ebilmek var olmak kullanılmış. Vektör sindirim örneğin özel Jel Elektroforez tarafından eksiksiz olduğunu kontrol etmek önemlidir. Karşılaştırma için sindirilmemiş vektör paralel olarak çalıştırılması gerekir. Örnek saf sindirilir vektör miktarını ölçmek. Vektör için derleme ekler logosuna 2 kat molar fazlalığı ile ayarlayın. 20 µL tepki kullanım 100 ng vektörünün (yaş), 8.5 adımından sindirmek başına 12,2 ng, Ekle (adımından 7.1.), adım 8.1.2 derleme ana karışımı 15 µL. H2’ O. 50 ° c için 1 h kuluçkaya. Sütun arıtma kullanarak reaksiyonlar arındırmak. DNA H2O 75 µL içinde resuspend (veya uygun birim elektroporasyon ölçeğini bağlı olarak).Not: Dönüşüm verimliliği DNA saflık üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. Ek arıtma adımları (örneğin fenol/kloroform ayıklama) verimliliği artırmak. 9. elektro-yetkili TG1 E. coli hücreleri hazırlanması Tüm şişeler santrifüj kapasitesi ve şişeler sonraki doldurma ısıyla önce distile su ile durulama ve deterjanlar ücretsiz emin olun.Not: Bu adım dönüşüm verimliliği etkileyen herhangi bir kirleri çıkarmak için yardımcı olur. Su kullanımdan hemen önce atılmalıdır. Alternatif olarak, tek kullanımlık Santrifüjü şişe kullanımı tavsiye olabilir. Santrifüj şişeleri, tüpler ve electrocompetent hücreleri hazırlanması için kullanılan çözümler kullanmak için buz önceden soğutulmuş emin olun. Soğuk bir odada dönüşüm verimliliği etkileyen sıcaklık dalgalanmaları en aza indirmek için aşağıdaki adımları yapmak en iyisidir. 2TY orta hazırlayın. Bacto tryptone 16 g için 10 g maya özü ve NaCl, 5 g 1 L, mix ve basınçlı kap distile su ekleyin. Mağaza orta oda sıcaklığında. 2TY-agar kaplı bioassay yemekleri ve 10 cm Petri uygun antibiyotik içeren yemekler hazırlamak. Tabaklar 4 ° C’de depolayınNot: Antibiyotik seçimi gRNA ifade vektör, pgRNA-pLKO.1 için kullanım 100 µg/mL Ampisilin niteliğine bağlıdır. TG1 hücre 2TY orta (olmadan antibiyotik) 10 mL aşılamak için bir gliserol stoktan kazı. Kültür 37 ° c gece (~ 16 h) 225 rpm’de sallayarak ile kuluçkaya. 2TY orta (olmadan antibiyotik) 1 litre ile 10 mL (1/100 seyreltme) gecede kültürünün aşılamak ve eşit (perdeler içeren) iki 2 L şişeler arasında bölmek. Kültür 37 ° c, 225 0,55 bir OD600 nm (yaklaşık 1,5-2 saat sonra) ulaşılana kadar devir/dakika kuluçkaya. Bir Spektrofotometre OD600 nm düzenli olarak denetlemek için kullanın. Kültürler için 30 dk buzda chill. Kültür (önceden buzda soğutulmuş) eşit dört 500 ml’lik santrifüj şişe arasında bölünmüş. Santrifüj, 4.000 x g önceden soğutulmuş bir santrifüj 4 ° C’de 15 dakika. Supernatants dikkatle boşaltmak ve 1 birim (yani 250 mL) önceden soğutulmuş buz gibi steril distile H2O her santrifüj şişe ekleyin. Bakteriyel Pelet dönen veya şişeyi ters çevirme (veya gerekirse nazik pipetting) resuspend.Not: Küçük hacimli su ekleyerek Pelet resuspend daha kolaydır. Pelet sonunda tamamen resuspended emin olun. Santrifüj, 4.000 x g 4 ° C’de 15 dakika Yıkama iki kez tekrarlayın (9,12 adımlar. ve 9,13). Süpernatant kaldırın. Bakteriyel Pelet yıkandıktan sonra giderek daha gevşek hale geldikçe decanting dikkatli olun. Pelet 50 mL steril, buz gibi % 10 gliserol resuspend ve öncesi soğutulmuş 50 mL santrifüj tüpü aktar. Santrifüj hücreleri, ~ 4.000 x g 4 ° C’de 15 dakika Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın. Yavaşça buz gibi steril % 10 gliserol 2 mL bakterilerde resuspend. Hücreleri hemen adım için kullanılacak ise buz üzerinde tutun.Not: Hücreleri olabilir 50 µL 0.5 mL tüpler bir kuru buz etanol banyoda aliquots donup kalan ev ve-80 ° C’de depolanan, ancak bu önerilmez. 10. TG1 Electrocompetent E. coli hücre çoğalmasıyla Not: Elektroporasyon darboğazlar kapsamlı Kütüphane üretimi biridir. Kitaplığı temsil korumak için bu kadar çok bireysel elektroporasyon reaksiyonlar gerekli/uygulanabilir yapmak için ve aşağıda açıklanan kalite kontrol adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir (10,6. ve 10,8.). Aliquot arıtılmış tepkiler (Adım 8.8) içine steril ve önceden soğutulmuş PCR tüpleri ve buz (tüp başına 1 µL) saklayın. 1 mm boşluk elektroporasyon cuvettes buz soğuk. 25 µL taze hazırlanmış TG1 hücrelerinin DNA bir aliquot için doğrudan eklemek ve hemen karışımı bir elektroporasyon küvet aktarın. Flick veya dokunun hücre DNA’sı karışımı sağlamak için küvet küvet haznesi (olmadan herhangi bir kapana kısılmış hava veya baloncuklar) uzunluğu boyunca dağıtılır. Slayt odasında küvet koyun ve uygun adım programını başlatın (örneğin 1 darbe 1.8 kV (EC1)).Not: electroporator yay küvet fiske, odasında hiçbir hava kabarcıkları olduğundan emin olun ve yeniden deneyin diye 5,7 ve 6.0 Bayan arasında zaman sürekli yalan söylemeliyim. Hemen oda sıcaklığında 2TY orta 975 µL küvet için ekleyin. Bir aktarım pipet kullanarak, electroporated bakteri 50 mL tüp taşıyın. 10,2 adımları yineleyin. ve bir 50 mL tüp içinde bir kütüphane ile dönüştürülmüş tüm hücreleri toplamak. Toplam hacim belge. Kalite kontrol adım Taze oluşturulan elektro-yetkili hücreleri yetki ölçmek için bir ayrı elektroporasyon tepki kesilmemiş plazmid DNA (örneğin 10 pg pUC19 denetim plazmid) tanımlanmış bir miktar kullanarak gerçekleştirin. Bu 1.5 mL microfuge tüp aktarın.Not: En az10 koloni oluşturan başına 10 adet (cfu) µg DNA yetkinlik olmalıdır. Taze hazırlanmış hücreleri genellikle bundan daha iyi performans sağlar. 60 dk. 225 rpm’de sallayarak için 37 ° C’de dönüştürülmüş bakteri kuluçkaya. Kalite kontrol adım: Plaka uygun antibiyotik seçimi ile 10 cm agar tabakta (örneğin 10 10-100 kat seyreltme µL) kitaplığıyla dönüştürülmüş bakteri tanımlanmış az miktarda.Not: Toplam kültür birim (adım 10,6) bilerek, elde edilen koloni sayı kolonileri tüm kitaplığı için toplam sayısını tahmin etmek için kullanılabilir. 20-30 kat temsil kitaplığın ideal olarak sağlanmalıdır. Uygun antibiyotik seçimi içeren 2TY kaplı agar bioassay yemekleri üzerine bakterilerin kalan dağıtmak.Not: Kültür hacmi Santrifüjü ~ 4.000 x g 10 dk (veya görünür Pelet oluşturmuştur ve süpernatant temiz görüntüleninceye kadar), tarafından azaltılabilir. Bu plakalar kültürünü yaymak sonra kuruması için gereken zamanı azaltır. Sıvı kültür yerine tabak kullanımı bireysel kolonileri orantısız büyüme en aza indirir. 13 PUC19 denetim elektroporasyon tepki olarak uygun antibiyotik seçimi ile bir ek 10 cm agar çanak uygun bir hacmi yayıldı. Ağar kaplamalar gecede (16 h) 37 ° C’de kuluçkaya Elde edilen kolonileri CFU/µg DNA bakteriler için tahmin etmek için denetim plakaları (pUC19 ve Denetim Kitaplığı plaka) Kütüphane karmaşıklık yanı sıra saymak. 11. plazmid DNA ekstraksiyon 2-TY medya 10 mL gecede plakayı ekleyin, bakteriyel katman tek kullanımlık bir ayırıcı kullanarak plaka kapalı kazımak ve bir 50 mL tüp içinde toplamak. Tüm plaka görünene kadar temiz bir kaç kere tekrar edin. DNA bir plazmid Maxi Kiti (2-3 sütun biyo-tahlil plaka) kullanarak ayıklayın.