Un protocole universel pour à grande échelle gRNA bibliothèque Production provenant de toute Source d’ADN

1. la digestion de l’ADN avec une nucléase micrococcique Effectuer une réaction d’optimisation pour chaque nouveau lot d’enzyme nucléase micrococcique (MNase).Remarque : Le nombre d’unités de MNase utilisés doit être testé (en utilisant une dilution en série, Figure 2 a). Habituellement, 5-10 U de MNase digérer 1 µg de purifiée génomique ou ADN vers le bas pour une gamme de 5 à 100 bp avec les conditions décrites ci-dessous. Par réaction, mis en place 1 µL de mémoire tampon MNase 10 x, 1 x albumine sérique bovine (BSA), 1 µg d’ADN, 1 µL de MNase cible (0,1 à 50 unités) dans un volume réactionnel de 10 µL. Incuber à 37 ° C pendant 15 min. Inactiver immédiatement l’enzyme en ajoutant 1 µL de 500 mM ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tétraacétique (EGTA). 2. séparation de l’ADN des Fragments à l’aide de l’électrophorèse sur Gel de Polyacrylamide (PAGE) Ajouter échantillon tampon/gel colorant aux échantillons d’ADN de chargement et les charger sur un 20 % gel de PAGE. Charger une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement (5 bp échelle d’ADN). Ne surchargez pas le gel (1 µg ADN / puits). Exécuter les gels dans approprié 1 x TRIS-Borate-EDTA (TBE) en cours d’exécution un tampon à 150 V (constant) pour autour de 1,5 h ou jusqu’à ce que la partie inférieure avant de colorant (bromophénol couleur bleu foncé, bleu) qui se déplace à environ 15 bp, atteint l’extrémité inférieure du gel. Souillez le gel à l’aide d’une teinture ultra-sensible des acides nucléiques et visualiser sous la lumière UV. À partir de l’image de gel, déterminer la concentration optimale de MNase pour digestion ADN jusqu’à 20-30 bp en taille. Utiliser la concentration optimisée de MNase pour digérer l’ADN cible en répétant les étapes 1,2-2,2. En général, mise en place de 10-12 réactions (c’est-à-dire 10 à 12 µg de matière première au total) produira assez digéré suivant PAGE gel extraction de l’ADN pour passer aux étapes suivantes. À l’aide d’un scalpel stérile, couper le gel à côté de la voie de marqueur et tache uniquement la partie du gel contenant l’échelle avec frais 1 x TBE en cours d’exécution un tampon contenant 1 X d’une tache ultra-sensible des acides nucléiques. Visualiser l’échelle d’ADN et d’accise de fragments d’ADN digéré MNase dans la gamme de taille entre environ 18-30 ans bp à l’aide d’une lame de rasoir.Remarque : Évitez d’exposer les fragments MNase digéré à la lumière UV. Il est possible d’utiliser une source de lumière bleue (au lieu de UV) ou prendre une image de l’échelle sous exposition aux UV, imprimez-le pour multiplier et utilisez-le pour guider l’excision des fragments d’ADN digéré MNase). Cette étape permet d’éviter la coloration et l’exposition de fragments d’ADN à la lumière UV. Toujours utiliser un scalpel jetable inutilisé et stérile ou la lame de rasoir pour cette étape pour éviter la contamination. Transférer la tranche de gel dans un tube de microcentrifuge. Colorer le reste du gel avec tache acide nucléique comme ci-dessus, exposer à la lumière UV et d’enregistrer une image afin de conserver un enregistrement de l’étape de l’excision de gel. 3. séparation des Fragments d’ADN de PAGE-gels à l’aide de l’écrasement et la méthode de trempage Remarque : Cette étape a été adoptée de Sambrook et al. 11 Préparer PAGE tampon de solubilisation de gel (1,88 mL d’acétate d’ammonium 4 M, 150 µL d’acétate de magnésium 1 M, 30 µL de 0,5 M l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (pH 8) à ultrapure H2O pour un volume total de 15 mL). Écraser la tranche excisés gel contre le mur du tube à l’aide d’un embout de la pipette stérile micro-centrifuge. Ajouter les 2 volumes de mémoire tampon de la PAGE la solubilisation de gel et incuber à 37 ° C pendant 16 h sur une plate-forme tournante. Centrifuger les échantillons pendant 1 min à vitesse maximale dans une micro-centrifugeuse. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge, prenant soin de ne pas pour transférer des morceaux de gel concassée. Ajouter 0,5 volumes de tampon de solubilisation de PAGE au gel-pellet, vortex et répétez la centrifugation (étape 3.4). Combiner les surnageants. Extraire les fragments d’ADN à l’aide d’extraction standard phénol-chloroforme.ATTENTION : Le phénol est toxique si elle entre en contact avec la peau ou ingestion. Précautions de sécurité tels que des gants, des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et en travaillant dans une hotte de laboratoire sont essentielles. Éliminer tous les déchets contenant du phénol conformément aux règlements de l’Institut. Ajouter un volume de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (25:24:1) dans l’échantillon et le vortex soigneusement. Centrifuger pendant 10 min à vitesse maximale (16 000 x g) dans une centrifugeuse de table à la température ambiante. Transvaser avec soin la phase aqueuse supérieure à un tube de microcentrifuge fraîches. Prendre soin de ne pas pour reporter sur n’importe quel phénol pendant le pipetage. Répétez les étapes 3.6.1 et 3.6.2 une fois. Ajouter une petite quantité (0.2 µL) du glycogène, des volumes 0,1 M 3 d’acétate de sodium (pH 5,2) et 2 volumes de 100 % d’éthanol (EtOH). Vortex et incuber à-20 ° C pendant plusieurs heures ou toute la nuit. Centrifuger pendant 30 min à la vitesse maximale à 4 ° C à l’aide d’une centrifugeuse de table. Avec précaution, retirez le surnageant et laver le culot d’ADN avec 70 % EtOH. Centrifuger pendant 30 min à la vitesse maximale à 4 ° C à l’aide d’une centrifugeuse de table. Retirez le surnageant et le culot d’ADN sécher à l’air. Assurez-vous que tous le EtOH se soit évaporée, mais veillez à ne pas trop sécher le culot. Dissoudre le culot d’ADN dans 12 µL d’H2O.NOTE : PAGE gel extraction est très inefficace. Pour chaque 10 µg de démarrage ADN digéré avec MNase, s’attendre à récupérer 1-20 ng de fragments purifiés après extraction du gel. Contrôler le montant et l’intégrité des fragments de chargement 1/6ème (2 µL) sur un gel de la PAGE (Figure 2). 4. fin réparation des Fragments digérés MNase, purification Gel Mettre en place la réaction suivante à l’aide d’un ADN émoussant kit : 10 µL de l’ADN purifié de l’étape 3.6.10, 1,5 µL de 10 X émoussant 1,5 µL du mélange dNTP 1 mM, 0,6 µL d’enzyme émousser, tampon, 1,4 µL d’H2O. Incuber à 22 ° C pendant 30 min et puis chaleur-inactiver l’enzyme par incubation à 70 ° C pendant 10 min. Ajouter 85 µL d’H2O et effectuer un réaction nettoyage à l’aide de standard phénol/chloroforme-extraction et EtOH-précipitations (tel que décrit à la section 3.6). Procéder immédiatement à la ligature de l’éditeur de liens. 5. génération de linker NOTE : Linkers ont besoin d’être amplifié en parallèle avec l’article 3, pour être en mesure de procéder immédiatement à la ligature de l’éditeur de liens. Séquences d’amorces utilisées ci-dessous doivent être appropriées pour le vecteur d’expression gRNA choisie. Celles qui sont présentées ici ont été conçus pour le vecteur Pan-RPGAA-pLKO.1. 9 pour l’amplification de l’éditeur de liens 5′ de Pan-RPGAA-pLKO.1, utiliser l’apprêt séquences 5′-linker-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) et 5′-linker-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), ce qui donne un amplicon bp 689. Pour l’amplification de l’éditeur de liens 3′ de Pan-RPGAA-pLKO.1, utiliser les amorces 3′-linker-F: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) et 3′-linker-r : (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), qui produisent un amplicon bp 848. PCR-amplifier l’adaptateur des séquences du vecteur d’expression gRNA (à l’aide de réactifs de choix et de séquences d’apprêt personnalisées, si nécessaire). Pour Pan-RPGAA-pLKO.1 mis en place la réaction PCR de 50 µL à l’adresse suivante : 25 µL du mélange maître PCR, 2,5 µL d’apprêt F (10 µM), 2,5 µL de primer R (10 µM), 0,1 ng de vecteur d’expression gRNA (Pan-RPGAA-pLKO.1) H2O. Incuber les réactions sur un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle de 98 ° C pendant 30 s, 32 cycles 98 ° C pendant 10 s, 59 ° C pendant 10 s, 72 ° C pendant 30 s, 1 cycle de 72 ° C pendant 10 min. Purifier les réactions de PCR en phase solide immobilisation réversible billes selon les instructions du fabricant. Éluer dans 30 µL d’H2O. Pour appliquer la ligature directionnelle de l’éditeur de liens aux fin-réparé, digérés MNase des fragments d’ADN, linkers digest avec des enzymes de restriction appropriées (ici HindIII et SacII). Mettre en place les réactions suivantes : Pour la digestion de l’éditeur de liens 5′ avec HindIII, utiliser 30 µL de linker amplicon purifiée 5′ de l’étape 5.3., 5 µL de tampon, 3 µL de HindIII (20U/µL) et 12 µL d’H2O. Pour la digestion de 3′ linker avec SacII, utiliser 30 µL de linker amplicon purifiée de 3′ de l’étape 5.3., 5 µL de tampon, 3 µL du SacII (20 U/µL) et 12 µL d’H2O. Incuber les digestions à 37 ° C pendant 3 h. Ajouter le gel d’ADN chargement colorant et exécuter les condensés de l’enzyme de restriction sur un gel d’agarose à 1 %. Exciser les bandes à 637 bp (5′ digest de l’éditeur de liens) et 295 bp (3′ digest de l’éditeur de liens). Purifier l’ADN les morceaux excisés gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel. 6. linker ligature et Amplification d’Inserts Mettre en place une réaction de ligature 14 µL à l’aide de quantités équimolaires de fragments digérés MNase, réparé à la fin et les séquences de l’éditeur de liens.NOTE : Linker ratios fragment peut être optimisé. Il est recommandé d’inclure une réaction de contrôle non-fragment (NFC). L’utilisation de 5 ng de digéré MNase fragments (fin-réparé et purifiée), 120 ng de l’éditeur de liens 5′ (HindIII digest, purifiée), 55 ng de 3′ linker (Sacrecueil II, purifiée), 1,4 µL de T4 ligase tampon et 1,4 µL du concentré T4 DNA ligase, en H2O. Incuber les réactions de ligature à 16 ° C pendant 16 h. Faire pas chaleur-inactiver l’enzyme. Procéder immédiatement à l’entaille-traduction.Nota : Les fragments digérés MNase réparé à la fin donnent les 5′ phosphates nécessaires pour la ligature des linkers, comme l’éditeur de liens eux-mêmes sont non-phosphorylés. Pour la ligature de réaction (et la réaction de NFC) ajoutent ce qui suit : 25 µL de Taq 2 X mélange principal (capable de nick translation), 2,5 µL d’apprêt Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2,5 µL d’apprêt Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) et 6 µL de H2O. Inclure un contrôle non-modèle (NTC). Incuber les réactions sur un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle (nick translation) : 72 ° C pendant 20 min, 1 cycle : 95 ° C pendant 5 min, 3-4 cycles : 95 ° C pendant 15 s, 58 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 30 s, 1 cycle : 72 ° C pendant 5 min. Effectuer un réaction nettoyage à l’aide de billes d’immobilisées réversible en phase solide avec une perle rapport de 1:1 échantillon. Éluer à 40 µL d’H2O. Encore amplifier le fragment désiré (5′ linker + MNase fragmente + 3 ‘ éditeur de liens) à l’aide de réactifs appropriés de PCR et les amorces suivantes : Utiliser 12,5 µL du mélange maître PCR, 1,25 ml d’apprêt Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1,25 ml d’apprêt Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 2,5 µL de produit de traduction nick purifiée de l’étape 6.4. et 7,5 µL d’H2O. utiliser les conditions suivantes : 1 cycle : 98 ° C pendant 30 s, 10-16 cycles : 98 ° C pendant 10 s, 63 ° C pendant 10 s, 72 ° C pendant 15 s, 1 cycle : 72 ° C pendant 10 min.Remarque : Si nécessaire, plusieurs réactions peuvent être mises en place en parallèle pour qu’il y a suffisamment de produit PCR pour les étapes suivantes. Afin de visualiser les petites quantités de produit PCR sur gel d’agarose, mis en place des réactions supplémentaires comme dans l’étape 6.5 et augmenter le nombre de cycle de 15 à 32. Cette réaction peut servir de contrôle de la qualité, si amplimères ne sont pas visibles après 15 cycles. N’inclure également un aucun contrôle de modèle (NTC). 7. sélection de la taille Remarque : Cette étape sépare MNase fragments avec l’éditeur de liens correctement attaché 5′ et 3′ des fragments avec deux 5′ ou deux linkers 3′ selon la taille. Combiner tous les réactions de PCR 15-cycle de l’étape 6.5., ajouter ADN colorant de chargement et d’exécuter sur un gel d’agarose 0,8 %. La bande à 869 l’accise bp et purifier l’ADN en utilisant un gel extraction kit. Quantifier la quantité d’ADN (par exemple à l’aide d’un spectrophotomètre). 8. clonage de Fragments amplifiés par PCR dans le gRNA vecteur d’Expression par Gibson Assemblée Préparer l’Assemblée master mix comme suit :Remarque : Les étapes suivantes sont adaptées de Gibson et al. 12. Créer 6 mL de tampon de réaction isotherme en combinant 3 mL de 1 M Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris)-HCl pH 7.5, 300 µL de 1 M du MgCl, 60 µL de triphosphate de désoxyguanosine 100 mM (dGTP), 60 µL de triphosphate d’adénosine 100 mM (dATP) 60 µL de désoxythymidine 100 mM triphosphate (dTTP), 60 µL de triphosphate de désoxycytidine 100 mM (dCTP), 300 µL de 1 M le dithiothréitol (DTT), 1,5 g de polyéthylène glycol (PEG)-8000, 300 µL de 100 mM nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) à ultrapure H2O.NOTE : Cette mémoire tampon peut être aliquotés et congelés à-20 ° C. Créer 1,2 mL Assemblée master mix en combinant 320 µL de 5 X tampon de réaction isothermique, 3 µL de 10 U/µL T5 exonucléase, 20 µL de 2 U/µL ADN polymérase, 160 µL de 40 U/µL DNA ligase dans ultrapure H2O. utilisation 15 µL du mélange maître Assemblée 5 µl de insérer.Remarque : Le mélange maître Assemblée peut être aliquotés et congelés à-20 ° C, où il est stable depuis plus d’un an et peut tolérer plusieurs cycles de gel-dégel. Le montant choisi de l’exonucléase T5 est idéal pour une utilisation avec long porte-à-faux. Digestion de vecteur colonne vertébraleRemarque : Veillez à digérer une quantité suffisante de vecteur comme entrée pour le nombre de réactions de l’Assemblée à l’étape 8.3 souhaité. Par réaction, ajouter ce qui suit : digérer les 1,5 µg de vecteur d’expression gRNA (Pan-RPGAA-pLKO.1), 5 µL de tampon, 1,5 µL d’âgej’ai (5U/µL) et 38,5 µL d’H2O. Incuber à 37 ° C pendant 2 h. Déphosphorylation du vecteur linéarisé.Remarque : Cette étape est conseillée, mais pas absolument nécessaire. T5 exonucléase dans master mix supprimera surtout l’ âgej’ai porte-à-faux avant que la Taq DNA ligase a eu l’occasion d’agir. Par conséquent, trop re-ligature du vecteur ne devrait pas. Ajouter 2,5 µL d’enzyme phosphatase alkaline de crevette (rSAP, 1 U/µL). Incuber à 37 ° C pendant 30 min et ensuite désactiver l’enzyme en incubant à 65 ° C pendant 5 min. Effectuer la purification de l’ADNRemarque : Il est recommandé d’effectuer une étape d’extraction de gel d’agarose. Par ailleurs, colonne – ou perle de purification peut être utilisée. Il est important de vérifier que la digestion du vecteur est complete, par exemple par électrophorèse sur gel d’agarose. Pour comparaison, non digéré vecteur doit être exécuté en parallèle. Quantifier la quantité de purifiée vecteur digérée dans l’échantillon. Mettre en place l’Assemblée avec 2 fois excès molaire d’inserts à vector. Par 20 µL réaction utilisation 100 ng du vecteur (âgej’ai digérer de l’étape 8,5), 12,2 ng d’insérer (à partir de “Etape 7.1.), 15 µL du mélange principal de l’Assemblée de l’étape 8.1.2. H2O. Incuber à 50 ° C pendant 1 h. Purifier les réactions à l’aide de la purification de la colonne. Remettre en suspension l’ADN dans 75 µL d’H2O (ou échéant en volume selon l’échelle de l’électroporation).Remarque : L’efficacité de la transformation est grandement tributaire de pureté de l’ADN. Étapes de purification supplémentaire (p. ex. extraction de phénol/chloroforme) pourraient améliorer l’efficacité. 9. préparation des cellules d’Escherichia coli Electro-compétente TG1 S’assurer que tous les centrifuger bouteilles et flacons sont exempts de détergents par lavage et remplissage ultérieur à l’eau distillée avant l’autoclavage.Remarque : Cette étape permet d’éliminer toutes les impuretés qui peuvent affecter l’efficacité de transformation. L’eau doit être jetée immédiatement avant l’emploi. Alternativement, utiliser des bouteilles jetables de centrifugation peut être utile. Veiller à ce que centrifugeuse bouteilles, les tubes et les solutions utilisés pour la préparation des cellules electrocompetent sont réfrigérées sur l’avant de la glace de l’utiliser. Il est préférable d’effectuer les opérations suivantes dans une chambre froide pour réduire au minimum les fluctuations de température qui peuvent affecter l’efficacité de la transformation. Préparer le milieu 2TY. À 16 g de bacto tryptone, 10 g d’extrait de levure et 5 g de NaCl, ajouter de l’eau distillée à 1 L, mélanger et stériliser. Conserver le milieu à température ambiante. Préparer des plats biologiques 2TY-agar enduit et Pétri de 10 cm contenant l’antibiotique approprié. Stocker les plaques à 4 ° C.Remarque : Le choix de l’antibiotique dépend de la nature du vecteur d’expression gRNA, utilisation 100 µg/mL ampicilline pour Pan-RPGAA-pLKO.1. Grattez provenant d’un stock de glycérol de cellules TG1 pour ensemencer 10 mL de milieu de 2TY (sans antibiotiques). Incuber à 37 ° C pendant la nuit (~ 16 h) la culture avec la secousse à 225 t/mn. Ensemencer 1 L de milieu 2TY (sans antibiotiques) les 10 ml d’une culture (dilution 1/100) et diviser également entre deux flacons de 2 L (contenant des chicanes). Incuber à 37 ° C, 225 t/mn jusqu’à obtenir une nm DO600 de 0,55 (après environ 1,5 à 2 h), la culture. Utilisez un spectrophotomètre pour vérifier régulièrement les DO600 nm. Faites refroidir les cultures sur la glace pendant 30 min. Diviser la culture également entre quatre bouteilles de 500 mL Centrifugeuse (préalablement refroidie sur la glace). Centrifuger à 4 000 x g à 4 ° C dans une centrifugeuse préalablement réfrigérée pendant 15 minutes. Surnageants de décanter et ajouter 1 volume (soit 250 mL) d’avance réfrigérés glacee stérile distillée H2O à chacune des bouteilles centrifugeuse. Resuspendre le culot bactérien en agitant ou en inversant la bouteille (ou de pipetage doux, si nécessaire).Remarque : Il est plus facile de resuspendre le culot en ajoutant d’abord une petite quantité d’eau. S’assurer que la pastille est resuspendue complètement par la suite. Centrifuger pendant 15 min à 4 000 x g à 4 ° C. Répéter le lavage deux fois (étapes 9.12. et 9.13). Retirez le surnageant. Soyez prudent lors de la décantation comme le culot bactérien devient plus en plus lâche après le lavage. Resuspendre le culot dans 50 mL de glycérol à 10 % stérile, glacée et transférez-le dans un tube à centrifuger avant réfrigéré 50 mL. Cellules de Centrifuger pendant 15 min à ~ 4 000 x g à 4 ° C. Retirer délicatement le surnageant. Doucement remettre en suspension les bactéries dans 2 mL de glacee glycérol stérile de 10 %. Rester sur la glace si les cellules doivent être utilisées immédiatement pour l’électroporation.Remarque : Les cellules peuvent être congelés en aliquotes de 50 µL dans des tubes de 0,5 mL dans un bain de glace sèche éthanol et conservés à-80 ° C, mais cela n’est pas recommandé. 10. l’électroporation des cellules d’Escherichia coli de TG1 Electrocompetent NOTE : Électroporation est l’un des goulets d’étranglement dans la production de la bibliothèque complète. Afin de préserver la représentation de la bibliothèque, il est recommandé d’effectuer des réactions individuelles électroporation autant que nécessaire/possible et à effectuer les opérations de contrôle de la qualité décrites ci-dessous (10.6. et 10,8.). Aliquote les réactions purifiées (de l’étape 8,8) en PCR stérile et préalablement réfrigérée tubes et gardez-les sur glace (1 µL par tube). Faites refroidir 1 mm écart électroporation cuvettes sur la glace. Ajouter 25 µL de cellules de TG1 fraîchement préparés directement à une partie aliquote d’ADN et immédiatement transférer le mélange dans une cupule d’électroporation. Flick ou robinet la cuve pour assurer le mélange de cellules/ADN est distribué sur toute la longueur de la chambre de la cuvette (sans air emprisonné ou bulles). Placez la cuve dans le compartiment de la glissière et démarrer le programme d’électroporation approprié (par exemple 1 impulsion de 1.8 kV (CE1)).Remarque : La constante de temps devrait se situer entre 5,7 et 6,0 m dans le cas où les arcs électroporateur, effleurer la cupule, assurez-vous il n’y a pas de bulles d’air dans la chambre et essayez à nouveau. Immédiatement ajouter 975 µL de température ambiante 2TY moyen dans la cuvette. À l’aide d’une pipette de transfert, déplacer les bactéries électroporés dans un tube de 50 mL. Répétez l’étape 10.2. et de recueillir toutes les cellules transformées avec une bibliothèque dans un tube de 50 mL. Le volume total du document. Étape de contrôle de la qualité Afin de quantifier la compétence des cellules fraîchement générés electro-compétentes, effectuer une réaction d’électroporation distinct à l’aide d’une quantité définie d’ADN (par exemple 10 pg pUC19 contrôle plasmidique) non circonci plasmidique. Ce transfert dans un tube de microtubes de 1,5 mL.Remarque : La compétence doit être au moins 1010 colonie unités formant (colonies UFC) par µg ADN. Les cellules fraîchement préparées généralement effectuent mieux que cela. Incuber les bactéries transformées à 37 ° C pendant 60 min en secouant à 225 t/mn. Étape de contrôle de la qualité : Plaque une petite quantité définie de bactérie transformée avec la bibliothèque (par exemple 10 µL d’une dilution de pli de 10-100) sur une gélose de 10 cm avec la sélection antibiotique appropriée.NOTE : Connaissant le volume total de la culture (de l’étape 10.6.), le nombre de colonies obtenues peut servir à estimer le nombre total de colonies pour l’intégralité de votre bibliothèque. représentation de pli de 20-30 de la bibliothèque devrait idéalement être maintenue. Disperse le reste de la bactérie sur 2TY agar enduit bioessai vaisselle contenant la sélection antibiotique appropriée.Remarque : Le volume de la culture peut être réduit par centrifugation à ~ 4 000 x g pendant 10 min (ou jusqu’à ce qu’un pellet visible s’est formé et le surnageant semble évident). Cela réduit le temps de plaques doivent sécher après la diffusion de la culture. Utilisation de plaques au lieu du milieu de culture liquide minimise la croissance disproportionnée des colonies individuelles. 13 Étendre un volume approprié de la réaction d’électroporation contrôle pUC19 sur un plat d’agar supplémentaires de 10 cm avec une sélection appropriée aux antibiotiques. Incuber les boîtes de gélose durant la nuit (16 h) à 37 ° C. Dénombrer les colonies obtenues sur les plaques de contrôle (contrôle et pUC19 plaque de bibliothèque) pour estimer les CFU/µg d’ADN de la bactérie ainsi que de la complexité de la bibliothèque. 11. extraction de l’ADN plasmidique Ajouter 10 mL de médias 2-TY aux plaques une nuit ou Pluss, gratter la couche bactérienne la plaque à l’aide d’un épandeur jetable et ramasser dans un tube de 50 mL. Répétez plusieurs fois jusqu’à ce que toute la plaque semble propre. Extraire l’ADN en utilisant un kit de plasmide Maxi (2 ou 3 colonnes nécessaires par Bio-essai sur plaque).