بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"
Summary
ينبغي أن تكون أساليب لإنشاء مكتبات واسعة النطاق جرنة بسيطة وتتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة. يصف لنا وضع بروتوكول لإنتاج مكتبات جرنة استناداً إلى الهضم الأنزيمي للهدف الحمض النووي. هذا الأسلوب، يعرض كورالينا (جرنة شامل مكتبة الجيل من خلال نشاط نوكلاس الخاضعة للرقابة) كبديل لتوليف اليغنوكليوتيد مخصصة مكلفة.
Abstract
شعبية للنظام كريسبر/Cas9 للجينوم والهندسة ابيجينومي ينبع من بساطته والقدرة على التكيف. ويستهدف المستجيب (نوكلاس Cas9 أو بروتين انصهار dCas9 نوكلاس-الميت) إلى موقع معين في الجينوم الجيش النيبالي الملكي صغيرة اصطناعية المعروفة بدليل الحمض النووي الريبي، أو جرنة. طبيعة النظام كريسبر ثنائي يمكن استخدامه في فرز النهج منذ بلازميد مكتبات الأشرطة التعبير التي تحتوي على الآلاف من جرناس الفردية يمكن استخدامها لاستجواب العديد من المواقع المختلفة في تجربة واحدة.
وحتى الآن، تم إنشاؤها تسلسل جرنة لتشييد المكتبات حصرا تقريبا بتوليف اليغنوكليوتيد، مما يحد من تعقيد يمكن تحقيقها من تسلسل في المكتبة وهي باهظة التكلفة نسبيا. هنا، البروتوكول مفصلاً كورالينا (جرنة شامل مكتبة الجيل من خلال نشاط نوكلاس الخاضعة للرقابة)، بسيطة وطريقة فعالة من حيث التكلفة لتوليد المكتبات جرنة معقدة للغاية تستند الهضم الأنزيمي لإدخال الحمض النووي، وهو وصف. حيث يمكن إنشاء مكتبات كورالينا من أي مصدر للحمض النووي، الكثير من الخيارات للتخصيص موجودة، تمكين مجموعة كبيرة ومتنوعة من الشاشات المستندة إلى كريسبر.
Introduction
بسبب تكييف النظام كريسبر/Cas9 البكتيرية كأداة استهداف جزيئي أحدث ثورة في البيولوجيا الجزيئية. ابدأ من قبل أنها لم تكن سهلة جداً للتلاعب الكروماتين في مواقع محددة بالجينوم. تشمل التطبيقات الشائعة كريسبر طفرات الجينات المستهدفة1، هندسة الجينوم2، ابيجينومي تحرير3والتنشيط النسخي والجينات إسكات4. إحدى مزايا خاصة للنظام كريسبر أن تطبيقاتها لا تقتصر على مواقع مرشحة مدروسة، مكتبات جرنة تشكل أقل من الشاشات منحازة. هذه تسهيل اكتشاف المكاني الوظيفية في الجينوم دون أي علم مسبق بالتجريبية. بيد حاليا معظمها يستند إلى بناء مكتبة جرنا توليف اليغو-النوكليوتيدات، وهناك خيارات محدودة لشراء مكتبات جرنا ليست للإنسان أو فتح مناطق المنشأ أو الهدف الماوس خارج قراءة الإطارات. وهكذا، على الرغم من أن شاشات كريسبر وبالفعل، أثبتت بشكل لا يصدق قوية5،6،،من78، كامل إمكاناتها لم لم تستغل.
مؤخرا وضعت للتغلب على الحد من جرنة الكلاسيكي توليد أساليب استراتيجيتين. على حد سواء تعتمد على الهضم الأنزيمي الخاضعة للرقابة للحمض النووي الهدف بدلاً من الاعتماد على توليف اليغنوكليوتيد مخصصة. بينما توظف كورالينا9 نوكلاس ميكروكوككال، الأسلوب البديل الوحيد المتاح حاليا، الأكل كريسبر10، يجعل استخدام إنزيمات التقييد (Hpaالثاني، سكرفالأول و منتدى بواو الآسيويالأول و مدامأنا). الأهم من ذلك، يمكن تطبيق التقنيات على حد سواء لأي إدخال الحمض النووي، والذي يخدم كمصدر لتسلسل بروتوسباسير جرنة. بينما تستخدم طريقة الأكل كريسبر استراتيجية لإنقاص عدد جرناس المستنسخة التي تستهدف مواقع لا يتبعها بام S.pyogenes المطلوبة (الدافع المتاخمة بروتوسباسير)، فإنه ينشئ سوى جزء صغير من جميع جرناس الفنية الممكنة منطقة بعينها. من ناحية أخرى، كورالينا، قادرة على توليد جميع جرناس المحتملة لتسلسل المصدر، ولكن يشمل أيضا نسبة أعلى من أدلة غير وظيفية. جرنا مكتبة جيل من خلال نشاط نوكلياسي التي تسيطر عليها تمكن من مكتبات جرنا شاملة لأي الأنواع، الإنتاج أي نظام Cas9-البروتين-أو المستجيب بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، كورالينا قابلة للتخصيص، والتكيف مع خيارات الإدخال وناقلات المناسبة تحديد مكتبة نوع وحجم ومحتوى. هنا، يرد بروتوكول تفصيلية التي يمكن استخدامها لتوليد مكتبات شاملة جرنة من مصادر متنوعة من الحمض النووي (الشكل 1)، بما في ذلك الصبغيات الاصطناعية البكتيرية (BACs) أو المجينية الحمض الخلوي الصبغي9. استخلصت النتائج التمثيلية المصاحبة لهذا البروتوكول بتطبيق البروتوكول كورالينا إلى BAC الحمض النووي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام كورالينا إنشاء مكتبات جرنة واسعة النطاق بالهضم نوكلاس الخاضعة للهدف الحمض النووي والاستنساخ الناتجة عن الشظايا الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة بالجملة. الاستدلال الإحصائي يشير إلى أن العديد من أكثر من 107 جرنة الفردية تسلسل قد سبق تم بنجاح استنساخ استخدام البروتوكول في اليد9. يمكن تخصيص كورالينا بطرق متعددة. اختيار قالب الحمض النووي يحدد المنطقة المستهدفة وتعقيد القصوى من المكتبة التي تم إنشاؤها. باستخدام هذا البروتوكول، مكتبات كورالينا تم إنشاؤها مسبقاً من الإنسان والفأر الحمض النووي9. تصور الممثلة النتائج المعروضة هنا توليد مكتبة كورالينا من الحمض النووي BAC المنقي. يمكن إجراء مزيد من التخصيص باختيار تسلسل المتجهات ورابط التعبير جرنة. اختبرناها سابقا ثلاثة أزواج مختلفة الأطوال رابط للجمعية جيبسون مع اختلافات قليلة في كفاءة9.
بسبب أصلهم من جل هضم الحمض النووي، بروتوسباسير جرناس كورالينا لا تكون عادة بالضبط 20 شركة بريتيش بتروليوم في الطول، ولكن تبين توزيع طول بمتوسط يعتمد كلاهما على معلمات هضم منسى بالإضافة إلى حجم الختان مصنوعة من جل صفحة س. المثال الممثل هو مبين في الشكل 2 ج، يصور الشظايا بطول متوسط بين bp 19 و 27. في تجربتنا، طول الأجزاء يتم الاحتفاظ بإخلاص بروتوسباسير جرنة الذي تم إنشاؤه9. بينما الشظايا أقصر من 20 bp ينبغي تجنبها بسبب ارتفاع معدل خارج الهدف من جرناس الناتجة، وشظايا أطول على الأرجح أقل بكثير من مشكلة بالنسبة للتطبيقات المصب، حيث أنه كان أظهر أن جرناس مع بروتوسباسيرس ما دامت 45 بي بي لا تزال 9من الوظيفية.
الخطوات الأكثر أهمية اثنين في البروتوكول كورالينا هي اختيار حجم الشظايا يهضم منسى وخطوات الاستنساخ. جيل شظايا التي قصيرة جداً (مثلاً في المتوسط دون سن 18 عاماً bp) أو إدراج عدد كبير من ناقلات التعبير جرنة فارغة سوف تجعل المكتبة غير مجدية. وبالتالي، من المهم تحسين الخطوة الهضم مناسى (الشكل 2A)، لرصد الختان (الشكل 2، ج)، التحقق من الهضم الكامل للعمود الفقري ناقلات جرنا بما في ذلك أية عناصر تحكم جزء في جميع أنحاء البروتوكول. وقد الرعاية الخاصة أيضا التي يجب اتخاذها للمحافظة على تمثيل المكتبة جرنا. بشكل عام هو عنق الزجاجة مشتركة واحدة من مكتبة الجيل كفاءة نقل البلازميدات إلى البكتيريا للتضخيم. وهكذا، أن كميات كبيرة من البكتيريا مع الكفاءات الممتازة وعدد كبير من الأحداث انهانسر الفردية ضرورية لتحقيق عدد كبير من الحيوانات المستنسخة جرنة.
استراتيجيات جديدة لإنتاج مكتبة جرنة سيكون ضروريا لحصاد الإمكانات الكاملة للنهج المستندة إلى كريسبر الفرز العقود القادمة. وهناك طلب كبير على طرق فعالة من حيث التكلفة وبسيطة وقابلة للتخصيص لإنشاء مكتبات واسعة النطاق، شرطا مسبقاً لإجراء الفحص قابلة لعدد أكبر من نظم نموذجية والنهج الهندسية المختلفة على أساس كريسبر. يتم توفير كورالينا خطوة أولى نحو هذا. وتتعدد الاستخدامات المحتملة، لا سيما لإنتاج مكتبات شاملة للجينوم، وكدنا المستمدة مكتبات نظم نموذجية أقل شيوعاً والمكتبات شديدة التركيز والهياكل التجريبية التي البروتينات كريسبر مختلفة (مع اختلاف بام وتستخدم في الجمع بين متطلبات).
وخلافا لأساليب أخرى، يولد كورالينا جرناس ممكن جميع من مدخلات الحمض النووي. ومع ذلك، هو عيب واحد من الأسلوب أن جرناس تفتقر إلى التسلسل بام المطلوبة مدرجة أيضا في المكتبة، وهي ميزة أنها تشترك مع طريقة الانزيمية ثانية لجرنا مكتبة الجيل، أكل كريسبر (الجدول 1). اختيار الأسلوب المثالي جرنة مكتبة الجيل تعتمد على مواصفات فحص المخطط التجربة، لا سيما الطبيعة (الجينية، التنظيمية، إينتيرجينيك) وحجم المنطقة المستهدفة (محور واحد، ومناطق متعددة، على نطاق الجينوم). أننا نرى رأسا على عقب خاصة في استخدام كورالينا عند عدد كبير من غير الترميز أو المناطق التنظيمية ليتم تحليلها، إذا كانت هناك معلومات ناقصة أو غير موثوق بها تسلسل (نظم نموذجية الغريبة، وخليط من الأنواع (مثل ميكروبيوميس) أو حصل تجريبيا الإدخال)، إذا كان يتم الجمع بين مختلف كريسبر اندونوكليسيس أو إذا تشبع تحليل يقوم على محور قصيرة ومحددة (مثل يمثلها BACs).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تود أن أشكر الأستاذ الدكتور ستيفان بيك والأستاذ الدكتور ماغدالينا غوتز مدخلاتها، والمساعدة والدعم في تطوير أسلوب كورالينا، ويسبيك ماكسيميليان وباومان فالنتين التعليقات المفيدة. العمل الذي أيده DFG (STR 1385/1-1).
Materials
| 500 mM EGTA | Sigma Aldrich | 03777-10G | 1.4., Inactivation of Mnase |
| Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6678 | 2.1. |
| Novex® TBE Gels, 20%, 10 well | Thermo Fisher Scientific | EC6315BOX | 2.1., pre-made 20 % PAGE gel |
| O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder, | Thermo Fisher Scientific | SM1303 | 2.1. |
| Novex® TBE Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6675 | 2.1., PAGE gel running buffer |
| Disposable scalpel, sterile | VWR | 233-5363 | 2.3., other equivalent reagents may be used |
| SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO) | Sigma Aldrich | S9430 |
2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563) |
| UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | Thermo Fisher Scientific | 15593-031 | 3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used |
| Glycogen | Sigma | 10901393001 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
| 3M Sodium acetate , pH5.2 | Thermo Fisher Scientific | R1181 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
| Ethanol | 3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade | ||
| Quick blunting kit | New England Biolabs | E1201 | 4.1. |
| ammomium acetate | Sigma | A1542 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
| magnesium acetate | Sigma | M5661 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | VWR | MOLEM37465520 (or Promega V4231) | 2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman coulter | A63881 | 5.3. + 6.5. |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | 5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used |
| concentrated T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | 6.1.+ 8.1.2. |
| Long Amp Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0287S | 6.3. |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | 5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used |
| HindIII | New England Biolabs | R0104S | 5.4.1. |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | 5.4.2. |
| AgeI | New England Biolabs | R0552S | 8.2.1. |
| Tris base | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
| 2M MgCl | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
| dGTP,dATP, dCTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | 8.1.1. |
| DTT | Sigam | DTT-RO |
8.1.1. |
| PEG-8000 | Sigma | P5413 |
8.1.1. |
| NAD | Sigma | N6522 |
8.1.1. |
| T5 exonuclease | New England Biolabs | M0363S | 8.1.2. |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | 8.1.2. |
| Taq DNA ligase | New England Biolabs | M0208L | 8.1.2. |
| rSAP | New England Biolabs | M0371S | 8.3.1. |
| TG1 competent cells | Lucigen | 60502-1 | 9.1. |
| 1mm gap electroporation cuvettes | VWR | 732-2267 | 10.2. |
| Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | DIS-988-010M | 9.4. |
| NaCl | Sigma | S7653 | 9.3. |
| Bacto-tryptone | BD | 211705 | 9.3. |
| Yeast extract | BD | 212750 | 9.3. |
| Agar | Sigma | A1296 |
9.4. |
| Glycerol | Sigma | G5516 |
9.17. |
| MNAse | New England Biolabs | M0247S | 1.1. |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | throughout |
| Micropulser | Biorad | 165-2100 | 10.2. |
| Electroporation cuvettes | Biorad | 732-2267 | 10.2. |
| 250 ml centrifuge tubes | Corning | 430776 | 9.1-9.9. |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).
- Lane, A. B., et al. Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening. Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. CSH Protoc. (1), (2006).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- Elsaesser, R., Paysan, J. Liquid gel amplification of complex plasmid libraries. Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).
