Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

1. a digestão do DNA com Nuclease Micrococcal Realize uma reação de otimização para cada novo lote de enzima nuclease micrococcal (MNase).Nota: O número de unidades de MNase usados deve ser testado (usando uma diluição serial, Figura 2A). Normalmente, 5-10 U de MNase digest 1 µ g de purificado genoma ou DNA BAC até um intervalo de 5-100 bp com as condições descritas abaixo. Por reação, configurar 1 µ l de 10 x MNase Buffer, 1 x albumina de soro bovino (BSA), 1 µ g do ADN, 1 µ l de MNase alvo (0.1-50 unidades) em um volume de reação de 10 µ l. Incube a 37 ° C por 15 min. Imediatamente, inativar a enzima adicionando 1 µ l de 500mm glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA). 2. separação de DNA fragmentos usando electroforese em Gel de poliacrilamida (PAGE) Adicionar a amostra reserva/gel corante para amostras de DNA de carga e carregar para um 20% gel PAGE. Carregar uma escada de DNA apropriada para dimensionamento (5 bp DNA Ladder). Não sobrecarregue o gel (1 µ g DNA por alvéolo). Corra géis no apropriado 1x TRIS-borato-EDTA (TBE) execução buffer a 150 V (constante) para em torno de 1,5 h ou até a menor frente de tintura (bromofenol azul, escuro cor azul) que viaja a cerca de 15 bp, atinge a extremidade inferior do gel. Manchar o gel usando uma mancha ultra sensível do ácido nucleico e visualize sob luz UV. Na imagem de gel, determine a concentração ideal de MNase para digestão de DNA até 20-30 bp em tamanho. Use a concentração otimizada de MNase para digerir o ADN do alvo, repetindo as etapas 1,2-2.2. Geralmente, criação de 10-12 reações (ou seja, 10-12 µ g do total de material começar) irão produzir suficiente digerido DNA após a extração do gel de página para prosseguir para as etapas subsequentes. Usando um bisturi estéril, cortar o gel ao lado da pista de marcador e mancha apenas a parte do gel contendo a escada com fresco 1 x TBE execução buffer contendo 1 X de uma mancha de ultra sensível do ácido nucleico. Visualize a escada de DNA e fragmentos de DNA digerido MNase na faixa de tamanho entre aproximadamente 18-30 bp usando uma lâmina de barbear impostos especiais de consumo.Nota: Evite expor os fragmentos MNase digerido à luz UV. É possível usar uma fonte de luz azul (em vez de UV) ou ter uma imagem da escada sob luz ultravioleta, imprimi-lo para escalar e usam isto para guiar a excisão de fragmentos de DNA MNase-digerido). Esta etapa evita manchar e exposição de fragmentos de DNA à luz UV. Sempre use um bisturi descartável estéril, não utilizada ou lâmina de barbear para esta etapa para evitar contaminação. Transfira a fatia de gel para um tubo de microcentrifugadora. Manchar o restante do gel com ácido nucleico mancha como acima, expor à luz UV e gravar uma imagem para manter um registro da etapa de excisão de gel. 3. isolamento de fragmentos de DNA de géis de página usando o esmagamento e o método de imersão Nota: Este passo foi adoptado pelo Sambrook et al . 11 Prepare página amortecedor de solubilização de gel (1,88 mL de acetato de amônio de 4 M, 150 µ l de acetato de magnésio de 1 M, 30 µ l de 0,5 M ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (pH 8) em ultrapura H2O para um volume total de 15 mL). Esmaga a fatia extirpado gel contra a parede do microtubo usando uma ponta de pipeta estéril. Adicione 2 volumes de tampão de solubilização de página do gel e incubar a 37 ° C, durante 16 h em uma plataforma giratória. Centrifugar as amostras por 1 min na velocidade máxima em um microcentrifuge. Transferi o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora novo, tomando cuidado para não transferir quaisquer pedaços de gel esmagado. Adicionar 0,5 volumes de tampão de solubilização de página para o gel de Pelotas, vórtice e repetir a centrifugação (passo 3.4). Combine os sobrenadantes. Extrair os fragmentos de DNA usando extração padrão fenol-clorofórmio.Cuidado: Fenol é tóxico se ele entra em contato com a pele ou ingestão. Precauções de segurança tais como luvas, óculos de proteção, jaleco e trabalhando em uma coifa são críticas. Elimine todos os resíduos que contenham fenol, de acordo com regulamentos do Instituto. Adicione um volume de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio (25:24:1) para a amostra e o vórtice completamente. Centrifugar por 10 minutos na velocidade máxima (16.000 x g) em uma centrífuga de mesa à temperatura ambiente. Transferi com cuidado, a fase aquosa superior para um tubo de microcentrifugadora fresco. Tome cuidado para não transitar qualquer fenol durante a pipetagem. Repita as etapas 3.6.1 e 3.6.2 uma vez. Adicionar uma pequena quantidade (0,2 µ l) de glicogênio, 0,1 volumes de acetato de sódio 3M (pH 5.2) e 2 volumes de 100% de etanol (EtOH). Vórtex e incubar a-20 º C por várias horas ou durante a noite. Centrífuga para 30 min na velocidade máxima a 4 ° C, utilizando uma centrífuga do tabletop. Cuidadosamente, remover o sobrenadante e lavar o sedimento de DNA com 70% EtOH. Centrífuga para 30 min na velocidade máxima a 4 ° C, utilizando uma centrífuga do tabletop. Remover o sobrenadante e secar o sedimento de DNA. Certifique-se de que todos o EtOH tenha evaporado, mas tenha cuidado para não secar demasiado a pelota. Dissolver o sedimento de DNA em 12 µ l de H2O.Nota: A extração do gel de página é muito ineficiente. Para cada 10 µ g de DNA digerido com MNase a começar, esperamos recuperar 1-20 ng de fragmentos purificados após a extração do gel. Controlar a quantidade e a integridade dos fragmentos carregando 1/6th (2 µ l) em um gel de página (Figura 2). 4. final reparação de fragmentos MNase-digerido, Gel-purificado Configurar a seguinte reação usando um DNA embotamento kit: 10 µ l de DNA purificado da etapa 3.6.10, 1,5 µ l de 10x embotamento buffer de 1,5 µ l do mix de 1 mM dNTP, 0,6 µ l da enzima embotamento, 1,4 µ l de H2O. Incubar a 22 ° C por 30 min e então calor-inativar a enzima por incubação a 70 ° C durante 10 min. Adicione 85 µ l de H2O e realizar uma reação limpar usando padrão fenol/clorofórmio-extração e EtOH-precipitação (conforme descrito na seção 3.6). Proceda de imediato à ligadura de vinculador. 5. o vinculador geração Nota: Linkers precisam ser amplificado em paralelo com a seção 3 para poderes prosseguir imediatamente com ligadura de vinculador. Usado abaixo de sequências da primeira demão devem ser apropriadas para o vetor de expressão gRNA escolhido. Aqueles aqui apresentados foram concebidos para o vetor pgRNA-pLKO.1. 9 para a amplificação do vinculador 5′ do pgRNA-pLKO.1, use a primeira demão sequências 5′-vinculador-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) e 5′-vinculador-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), rendendo um amplicon bp 689. Para a amplificação do vinculador 3′ do pgRNA-pLKO.1, use as primeiras demão 3′ vinculador-f: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) e 3′-vinculador-r: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), que rendem um amplicon bp 848. O adaptador de PCR-amplificar sequências do vetor de expressão de gRNA (usando reagentes de escolha e sequências de personalizado da primeira demão, se necessário). Para configurar a seguinte reação de PCR de 50 µ l do pgRNA-pLKO.1: 25 µ l de mistura de mestre de PCR, 2,5 µ l de primer F (10 µM), 2,5 µ l de primer R (10 µM), 0,1 ng do vetor de expressão de gRNA (pgRNA-pLKO.1) em H2O. Incubar as reações em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo de 98 ° C por 30 s, 32 ciclos 98 ° C por 10 s, 59 ° C, durante 10 s, 72 ° C por 30 s, 1 ciclo de 72 ° C por 10 min. Purifica as reações de PCR usando grânulos de imobilização reversível de fase sólida de acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 30 µ l de H2O. Para impor a ligadura direcional do vinculador aos fragmentos de DNA de final-reparado, MNase-digerido, linkers digerir com enzimas de restrição apropriadas (aqui HindIII e SacII). Configure as seguintes reações: Para a digestão de 5′ vinculador com HindIII, use 30 µ l de vinculador amplicons de purificado 5′ da etapa 5.3., 5 µ l de Buffer, 3 µ l de HindIII (20U / µ l) e 12 µ l de H2O. Para a digestão de 3′ vinculador com SacII, usar 30 µ l de 3 purificado ‘ vinculador amplicons da etapa 5.3., 5 µ l de Buffer, 3 µ l de SacII (20 U / µ l) e 12 µ l de H2O. Incube digere a 37 ° C por 3 h. Adicione gel ADN carregando tintura e executar digere a enzima de restrição em um gel de agarose 1%. Excisar as bandas em 637 bp (Resumo de vinculador de 5′) e 295 bp (3′ digest de vinculador). Purifica o DNA das peças extirpado gel usando um kit de extração do gel. 6. o vinculador ligadura e amplificação de inserções Configure uma reação de ligadura µ 14 l usando montantes equimolar de fragmentos MNase-digerido, fim-reparado e sequências de vinculador.Nota: O vinculador a rácios de fragmento pode ser otimizado. Recomenda-se incluir uma reação de controle não-fragmento (NFC). Uso 5 ng MNase-digerido fragmentos (final-reparado e purificado), 120 ng de 5′ vinculador (digerirHindIII, purificada), 55 ng de 3′ vinculador (SacII s digest, purificada), 1.4 µ l de T4 ligase Buffer e 1,4 µ l de concentrado ligase do ADN T4 em H2O. Incube as reações de ligadura a 16 ° C, durante 16 h. Fazer não calor-inativar a enzima. Proceda de imediato à conversão de nick.Nota: Os fragmentos MNase-digerido reparada a fim fornecem os necessário de 5′ fosfatos para ligadura dos linkers, como o vinculador si são un-fosforiladas. Para a ligadura da reação (e a reação de NFC) adicionam o seguinte: 25 µ l de Taq 2 X mestre mistura (capaz de nick tradução), 2,5 µ l de primer vinculador-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2,5 µ l de primer vinculador-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) e 6 µ l de H2O. Inclua um controle de não-modelo (NTC). Incubar as reações em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo (tradução de nick): 72 ° C por 20 min, 1 ciclo: 95 ° C por 5 min, 3-4 ciclos: 95 ° C por 15 s, 58 ° C, por 15 s, 72 ° C por 30 s, 1 ciclo: 72 ° C por 5 min. Execute uma reação limpar usando grânulos de imobilização reversível de fase sólida com uma amostra para a proporção de grânulo de 1:1. Eluir em 40 µ l de H2O. Ampliar ainda mais o fragmento desejado (5’ vinculador + MNase + 3 do fragmento ‘ vinculador) usando reagentes apropriados do PCR e os primers a seguintes: Use a 12,5 µ l de mistura de mestre de PCR, 1,25 µ l de primer vinculador-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1,25 µ l de primer vinculador-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 2,5 µ l de produto de tradução nick purificado da etapa 6.4. e 7,5 µ l de H2O. Use as seguintes condições: 1 ciclo: 98 ° C por 30 s, 10-16 ciclos: 98 ° C, durante 10 s, 63 ° C, durante 10 s, 72 ° C por 15 s, 1 ciclo: 72 ° C por 10 min.Nota: Se necessário, várias reações podem ser configurar em paralelo para garantir que não há suficiente produto do PCR para as etapas subsequentes. Para visualizar a pequenas quantidades do produto do PCR em um gel de agarose, configurar reações adicionais como na etapa 6.5 e aumentar o número de ciclo de 15 a 32. Esta reação pode ser usada como controle de qualidade, se amplicons não são visíveis após 15 ciclos. Incluem também um sem controle do modelo (NTC). 7. seleção do tamanho Nota: Este passo separa MNase-fragmentos com o vinculador corretamente anexado de 5′ e 3′ fragmentos com dois 5′ ou dois 3’ linkers baseiam no tamanho. Combinar todas as reações de PCR 15-ciclo da etapa 6.5., adicionar DNA tintura a carregar e executar em um gel de agarose 0,8%. Impostos especiais de consumo a banda proeminente em 869 bp e purificar DNA usando um kit de extração do gel. Quantificar a quantidade de DNA (por exemplo, usando um spectrophotometer). 8. clonagem de fragmentos amplificados por PCR para o vetor de expressão por Gibson Assembly gRNA Preparar a Assembleia mestre mistura da seguinte forma:Nota: As etapas a seguir são adaptadas de Gibson et al . 12. Criar 6 mL de tampão de reação isotérmica combinando 3 mL de 1 M Tris (hidroximetil) aminometano (Tris)-HCl pH 7,5, 300 µ l de 1 M de MgCl, 60 µ l de trifosfato de Desoxiguanosina 100mm (dGTP), 60 µ l de trifosfato de Desoxiadenosina 100 mM (dATP), 60 µ l de cromatografia de 100mm trifosfato (dTTP), 60 µ l de trifosfato de Desoxicitidina 100mm (dCTP), 300 µ l de 1m ditiotreitol (DTT), 1,5 g de polietileno glicol (PEG)-8000, 300 µ l de 100mm nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) em ultrapura H2O.Nota: Esta reserva pode ser aliquotadas e armazenado a-20 ° C. Criar 1,2 mL montagem mestre mistura combinando 320 µ l de 5 X amortecedor da reação isotérmica, 3 µ l de 10 U / µ l T5 do exonuclease, 20 µ l de 2 U / µ l DNA polimerase, 160 µ l de 40 ligase de U / µ l de DNA em ultrapura H2O. uso de 15 µ l do mix de mestre de montagem com 5 µ l de inserir.Nota: A mistura de mestre de montagem pode ser aliquotadas e armazenado a-20 ° C, onde é estável por mais de um ano e pode tolerar vários ciclos de congelamento e descongelamento. A quantidade escolhida de T5 do exonuclease é ideal para uso com longas saliências. Digestão de espinha dorsal do vetorNota: Certifique-se de digerir uma quantidade suficiente de vetor como entrada para o número desejado de reações de montagem no passo 8.3. Por reação, adicione o seguinte: 1,5 µ g de vetor de expressão de gRNA (pgRNA-pLKO.1), 5 µ l de tampão, 1,5 µ l de idadeeu (5U / µ l) e 38,5 µ l de H2O. Incubar digerir a 37 ° C por 2 h. Desfosforilação do vetor tornado linear.Nota: Este passo é aconselhado, mas não é estritamente necessário. T5 exonuclease na mistura mestre principalmente removerá a idadeeu saliências antes o Taq DNA ligase tenha tido a oportunidade de agir. Portanto, não se espera excessiva re-ligadura do vetor. Adicione 2,5 µ l da enzima fosfatase alcalina de camarão (rSAP, 1 U / µ l). Incubar a 37 ° C por 30 min e em seguida, inativar a enzima incubando a 65 ° C por 5 min. Realizar a purificação do DNANota: É aconselhável executar uma etapa de extração do gel de agarose. Alternativamente, purificação do grânulo ou coluna pode ser usada. É importante verificar que a digestão de vetor é completa, por exemplo, por eletroforese em gel de agarose. Para comparação, o vetor não digerido deve ser executado em paralelo. Quantificar a quantidade de vetor digerido purificada na amostra. Configure a montagem com 2 vezes excesso molar de inserções para vector. Por 20 µ l reação uso 100 ng do vetor (idadeeu digiro da etapa 8.5), 12.2 ng de inserir (da etapa 7.1.), 15 µ l do mix mestre de montagem da etapa 8.1.2. em H2O. Incube a 50 ° C, durante 1 h. Purifica as reações usando purificação da coluna. Resuspenda o DNA em 75 µ l de H2O (ou apropriado volume, dependendo da escala de eletroporação).Nota: A eficiência de transformação é extremamente dependente de pureza do DNA. Etapas de purificação adicional (por exemplo, extração fenol/clorofórmio) podem melhorar a eficiência. 9. preparação de células de Escherichia coli competente Electro TG1 Certifique-se de que todos centrifugar garrafas e frascos estão livres de detergentes por lavagem e posterior enchimento com água destilada antes de esterilizar.Nota: Este passo ajuda a eliminar as impurezas que podem afetar a eficiência de transformação. Água, deve ser descartada imediatamente antes do uso. Alternativamente, o uso de garrafas descartáveis de centrifugação pode ser aconselhável. Certifique-se que garrafas de centrífuga, tubos e soluções utilizadas para a preparação de células electrocompetent são refrigeradas na prévia de gelo para usar. É melhor realizar as seguintes etapas em um quarto frio para minimizar as flutuações de temperatura que podem afetar a eficiência de transformação. Prepare 2TY médio. Com 16 g de bacto triptona, 10 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl, adicionem água destilada 1L, mistura e autoclave. Meio de armazenamento à temperatura ambiente. Prepare pratos de bioensaio 2TY-agar revestido e cm 10 placas de Petri contendo o antibiótico adequado. Placas de armazenamento a 4 ° C.Nota: A escolha do antibiótico depende da natureza do vetor de expressão de gRNA, uso 100 µ g/mL de ampicilina para pgRNA-pLKO.1. Raspa de um estoque de glicerol de células TG1 para inocular 10 mL de meio de 2TY (sem antibióticos). Incube a cultura, a 37 ° C durante a noite (~ 16 h), com agitação a 225 rpm. Inocular a 10 mL de cultura durante a noite (diluição 1/100) 1 L de meio de 2TY (sem antibióticos) e divida igualmente entre dois balões de 2 L (contendo os defletores). Incube a cultura a 37 ° C, 225 rpm até atingir uma OD600 nm de 0,55 (aproximadamente após 1,5 a 2 h). Use um espectrofotômetro para verificar OD600 nm regularmente. Culturas de frio no gelo por 30 min. Dividi a cultura igualmente entre quatro garrafas de 500 mL centrífuga (pré-refrigerado no gelo). Centrifugar por 15 min a 4.000 x g a 4 ° C em uma centrífuga previamente refrigerada. Sobrenadantes de decantar e adicionar 1 volume (ou seja, 250 mL) de pre-refrigerados gelada estéril destilada H2O para cada uma das garrafas de centrífuga. Resuspenda o pellet bacteriano por agitação ou invertendo o frasco (ou pipetando suave, se necessário).Nota: É mais fácil Ressuspender o primeiro adicionando um pequeno volume de água. Garantir que a pelota é completamente resuspended eventualmente. Centrifugar por 15 min a 4.000 x g a 4 ° C. Repetir a lavagem duas vezes (passos 9.12. e 9,13). Remova o sobrenadante. Tenha cuidado quando decantação como a pelota bacteriana torna-se cada vez mais solta, após a lavagem. Resuspenda o pellet em 50 mL de glicerol a 10% estéril, gelada e transferi-lo para um tubo de centrifugação pré-50ml refrigerados. Células de centrifugar por 15 min a ~ 4.000 x g a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Delicadamente Ressuspender as bactérias em 2 mL de glicerol a 10% estéril gelada. Manter em gelo, se as células devem ser usados imediatamente para eletroporação.Nota: As células podem ser congeladas em alíquotas de 50 µ l em tubos de 0,5 mL em banho de gelo seco-etanol e armazenadas a-80 ° C, mas isso não é recomendado. 10. eletroporação de células de Escherichia coli Electrocompetent TG1 Nota: Eletroporação é um dos gargalos em geração de biblioteca abrangente. Para preservar a representação de biblioteca, é recomendável realizar tantas reacções individuais electroporation quanto possível/necessário e para executar as etapas de controle de qualidade descritas abaixo (10.6. e 10.8.). Tubos de alíquota as reações purificadas (da etapa 8,8) em PCR estéril e pre-refrigerado e mantê-los no gelo (1 µ l pelo tubo). Fica frio cubetas de eletroporação de lacuna de 1 mm no gelo. Adicione 25 µ l de células de TG1 preparadas diretamente a uma alíquota de DNA e imediatamente, transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação. Súbito ou toque a cubeta para assegurar a mistura de células/DNA é distribuído ao longo do comprimento da câmara de cubeta (sem ar aprisionado ou bolhas). Colocar a cubeta na câmara de slide e iniciar o programa de eletroporação apropriado (por exemplo, 1 pulso de 1,8 kV (EC1)).Nota: A constante de tempo deve estar entre 5,7 e 6,0 ms. no caso dos arcos electroporator, flick a cubeta, garantir que não há nenhuma bolha de ar na câmara e tente novamente. Imediatamente adicione 975 µ l de temperatura 2TY médio para a cubeta. Utilizando uma pipeta de transferência, mova as bactérias electroporated para um tubo de 50 mL. Repita da etapa 10.2. e recolher todas as células transformadas com uma biblioteca em um tubo de 50 mL. O volume total do documento. Etapa de controle de qualidade Para quantificar a competência das células recém geradas electro-competente, realize uma reação de eletroporação separadas usando uma quantidade definida de uncut plasmídeo (por exemplo, 10 pg pUC19 controle do plasmídeo). Transferi isto para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.Nota: A competência deve ser pelo menos 1010 formadoras unidades (cfu) por µ g de DNA. Células preparadas geralmente executam melhor do que isso. Incube a bactéria transformada a 37 ° C por 60 min tremendo a 225 rpm. Etapa de controle de qualidade: Placa de uma pequena quantidade definida de bactéria transformada com a biblioteca (por exemplo, 10 µ l de uma diluição de dobra de 10-100) em uma placa de ágar de 10 cm com a seleção apropriada de antibióticos.Nota: Sabendo que o volume total da cultura (da etapa 10.6.), o número de colônia obtidos pode ser usado para estimar o número total de colônias por toda a biblioteca. representação de dobra de 20-30 da biblioteca idealmente deve ser mantida. Disperse o restante das bactérias para 2TY agar revestido bioensaio pratos contendo a seleção apropriada de antibióticos.Nota: O volume da cultura pode ser reduzido por centrifugação a ~ 4.000 x g durante 10 minutos (ou até um sedimento visível tem formado e o sobrenadante claro). Isto reduz o tempo de placas precisam secar após a disseminação da cultura. Uso de placas ao invés de cultura líquida minimiza o crescimento desproporcional das colônias individuais. 13 Espalhe um volume adequado da reação de eletroporação de controle pUC19 em um prato de ágar de adicional de 10 cm com seleção antibiótica apropriada. Incubar as placas de ágar durante a noite (16 h) a 37 ° C. Conte colônias obtidas com as placas de controle (placa pUC19 e controle da biblioteca) para estimar CFU / µ g DNA para as bactérias bem como a complexidade de biblioteca. 11. extração de DNA de plasmídeo Adicionar 10 mL de mídia 2-TY para as placas durante a noite, raspar a camada bacteriana no prato usando um difusor de descartável e recolhê-la em um tubo de 50 mL. Repita algumas vezes até que todos da placa aparece limpo. Extrair DNA usando um kit de plasmídeo Maxi (2-3 colunas necessárias por Bio-ensaio da placa).