大規模な gRNA ライブラリ生産 DNA の任意のソースからの普遍的なプロトコル

1. ミクロコッカスヌクレアーゼと DNA の消化力 ミクロコッカスヌクレアーゼ酵素 (MNase) の各の新しいバッチに対して最適化反応を実行します。注: 使用 MNase の単位の数は、(図 2 a、シリアル希釈を使用して) テスト必要があります。通常、5-10 MNase U ダイジェスト 1 μ g の精製ゲノムか以下の条件で 5 100 bp の範囲に BAC DNA。 MNase バッファー x 10、ウシ血清アルブミン (BSA)、ターゲット DNA の MNase の 1 μ L の 1 μ g x 1 の 1 μ L を反応ごとの設定 (0.1 〜 50 台) 10 μ L 反応ボリュームで。 37 ° c 15 分間インキュベートします。 すぐに 500 mM エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N の 1 μ L を追加することによって、酵素を不活性化 ‘、N’-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)。 2 ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) を使用してフラグメントの DNA の分離 サンプル バッファー/ゲルの DNA サンプルにローディングの染料を追加し、ページのゲル 20% の上にロードします。サイズ変更のための適切な DNA の梯子を読み込む (5 bp DNA の梯子)。ゲル (ウェルあたり 1 DNA μ g) をオーバー ロードしません。 Bp、ゲルの下端に達すると 1.5 h の前後約 15 で下の色素フロント (ブロモフェノール ブルー、濃いブルー色) までの適切な 1 x TRIS ホウ酸 EDTA (TBE) 連続したバッファー 150 V (定数) でゲルを実行します。 超高感度核酸染色を使用してゲルを染色し、紫外線の下で視覚化します。 ゲル画像からサイズで 20-30 bp まで消化の DNA に MNase の最適な濃度を決定します。 手順 1.2 2.2 を繰り返すことによってターゲット DNA を消化するのに MNase 濃度の最適化を使用します。通常、以降のステップに進むために次のページのゲルの抽出 DNA を消化反応 (すなわち10-12 出発物質合計の μ g) を行えば、十分 10-12 を設定します。 生殖不能のメスを使用して、マーカー レーンの隣にゲルをカットし、超高感度核酸染色の 1 X を含む新鮮な 1 x TBE 実行バッファーではしごを含んでいるゲルの部分だけを染色します。DNA の梯子を視覚化し、消費税約 18 30 bp のかみそりの刃を使用しての間の大きさの範囲に MNase 消化 DNA のフラグメント。注: は、UV ライトに MNase 消化フラグメントの露出を避けます。それは) (紫外線) ではなく青い光源を使用または UV の下ではしごのイメージでスケール MNase 消化の DNA のフラグメントの切除をガイドするこれを使用してそれを印刷することが可能です。この手順では、染色、DNA のフラグメントの紫外線への露出を回避できます。常に汚染を避けるために未使用、滅菌使い捨てメスまたはこの手順のかみそりの刃を使用します。 微量遠心チューブにゲルのスライスを転送します。 上記として核酸染色ゲルの残りの部分を染色、UV ライトに公開し、ゲル切除手順の記録を保持するイメージを記録します。 3. ときめきと浸漬法を用いたページ ゲルからの DNA のフラグメントの分離 注: この手順は、Sambrookらから採用されています11 ゲル可溶化バッファー (4 M 酢酸アンモニウム、酢酸マグネシウム 1 M 150 μ、30 μ L の純水 H2O 15 mL の容量で 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (pH 8) 1.88 mL) ページを準備します。 滅菌ピペット チップを用いたマイクロ遠心チューブの壁切除のゲルのスライスをつぶします。 2 ページ可溶化バッファーのボリュームをゲルし、, 回転プラットフォーム上で 16 時間 37 ° C で追加します。 遠心機の最高速度で 1 分間サンプルを遠心します。任意の押しつぶされたゲルの部分を転送しないように世話、新しい微量遠心チューブに上清を転送します。 0.5 を追加ゲルにページ可溶化バッファーのボリューム ペレット、渦、および遠心分離 (ステップ 3.4) を繰り返します。培養上清を組み合わせます。 標準的なフェノール-クロロホルム抽出法を用いた DNA 断片を抽出します。注意: 皮膚に接触する場合や誤って飲み込んだ場合は、フェノールは有毒です。手袋、保護眼鏡、白衣、ヒューム フードでの作業などの安全対策が重要です。研究所の規則に従ってすべてのフェノールを含む廃棄物の処分します。 徹底的にサンプルと渦にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) の 1 つのボリュームを追加します。 最高速度 (16,000 x g) 卓上遠心室温で 10 分間遠心します。慎重に新鮮な遠心管に上層の水相を転送します。ピペッティング時に任意のフェノールを引き継ぐように注意してください。 3.6.1 と 3.6.2 の手順をもう一度繰り返します。 グリコーゲン、3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) の 0.1 ボリュームの小さな量 (0.2 μ L) を追加し、100% エタノール (エタノール) の 2 つの容積。 渦、-20 ° C でインキュベートするいくつかの時間または一晩します。 卓上型遠心分離機を使用して 4 ° C で最大速度で 30 分間遠心します。 慎重に上澄みを除去し、DNA のペレットを 70 %etoh。 卓上型遠心分離機を使用して 4 ° C で最大速度で 30 分間遠心します。 上澄みを除去し、空気乾燥 DNA の餌。すべてのエタノールが蒸発したことを確認しかし、ペレットを過剰に乾燥しないように注意してください。 H2o. の 12 μ L の DNA ペレットを溶解します。注: ページのゲルの抽出は非常に効率的ではありません。MNase と消化される DNA の開始のすべての 10 μ g、ゲルの抽出後に精製されたフラグメントの 1 20 ng を回復に期待します。1/6thを読み込むことによって量とフラグメントの整合性を制御 (2 μ L) ページのゲル (図 2)。 4 エンド MNase 消化、ゲル精製断片の修復 キットを鈍化 DNA を使用して次の反応を設定: ステップ 3.6.10、鈍化バッファー、1 mM dNTP ミックス 1.5 μ、モデル酵素の 0.6 μ L、1.4 μ L H2o. の X 10 の 1.5 μ L から精製した DNA の 10 μ L 22 の ° c で 30 分間インキュベートし、酵素の熱を 70 ° C の 10 分の間孵化によって不活性. H2O の 85 μ L を追加し、反応クリーンアップ標準のフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿 (セクション 3.6 で説明) を使用してを実行します。リンカー結紮に進んでください。 5. リンカー世代 注: リンカーはセクション 3 リンカー結紮をすぐに続行することができるようにすると同時に増幅する必要があります。以下使用のプライマー シーケンスは選択した gRNA の表現のベクトルのために適切である必要があります。ここで紹介はベクトルの pgRNA pLKO.1 のために設計されています。9 pgRNA pLKO.1 から 5′ リンカーの増幅、プライマー シーケンス 5′-リンカー-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) および 5′-リンカー-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC) 689 bp 私アンプリコンを降伏を使用します。PgRNA pLKO.1 から 3′ リンカーの増幅用プライマー 3′-リンカー-f: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) と 3′-リンカー-r: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC)、848 の bp 増幅をもたらす。 PCR 増幅アダプターは (必要に応じて試薬の選択とカスタムのプライマー シーケンスを使用して) gRNA 発現ベクターからシーケンスします。PgRNA pLKO.1 次の 50 μ L の PCR 反応を設定の: PCR マスター ミックスの 25 μ L、F のプライマーの 2.5 μ L (10 μ M)、プライマー R の 2.5 μ L (10 μ M)、0.1 gRNA 発現ベクター (pgRNA-pLKO.1) H2o. での ng 次の条件を使用してたちの反応を孵化させなさい: 1 サイクル 30 98 ° C s、32 サイクル 98 ° C 10 s、59 ° C、10 s 72 ° C、30 秒、10 分の 1 サイクル 72 ° C。 製造元の指示に従って固相リバーシブル固定化ビーズを用いた PCR 反応を浄化します。H2o. の 30 μ L の溶出します。 最後修理、MNase 消化 DNA のフラグメント リンカー、(ここでハインドIII とSacII) 適切な制限の酵素のダイジェスト リンカーの方向結紮します。次の反応を設定します。 5’ハインドIII をリンカーの消化、30 μ L の精製された 5′ ステップ 5.3 から私アンプリコン リンカーを使用します、5 μ l のバッファー、ハインドIII (20U/μ l) の 3 μ l、12 μ l H2o.。 3′ SacII をリンカーの消化、30 μ L の精製 3′ ステップ 5.3 から私アンプリコン リンカーを使用します 5、バッファー、 SacII の 3 μ l の μ l (20 U/μ l)、と 12 μ l H2o.。 3 h の 37 ° C でダイジェストを孵化させなさい。 DNA ゲルのローディングの染料を追加し、1% アガロースゲルの制限の酵素のダイジェストを実行します。637 でバンドを消費税 bp (5′ リンカー ダイジェスト) と 295 bp (3′ リンカー ダイジェスト)。 ゲル抽出キットを使用して摘出したゲル片から DNA を浄化します。 6. リンカー結紮と挿入の増幅 MNase 消化、最後修理断片およびリンカー シーケンスの等モルの量を使用して 14 μ L の ligation の反作用を設定します。注: リンカー フラグメント率を最適化できます。いいえフラグメントのコントロール (NFC) 反応を含めることをお勧めします。 MNase 消化フラグメント (エンド修理し、精製)、120 の 5 ng 5′ (ハインドIII ダイジェスト、精製)、リンカーの ng 55 3′ リンカー (SacII ダイジェスト、精製)、T4 リガーゼ バッファーの 1.4 μ L、1.4 μ L H2o. 集中 T4 DNA リガーゼの ng 16 h 16 ° C でライゲーション反応を孵化させなさい。ない熱は、酵素を不活性化します。ニック変換に進んでください。注: 終わり修理 MNase 消化フラグメントは、5′ リン酸必要なリンカーの結紮、リンカーとして自体が非 osphorylated。 結紮する反応 (と NFC 反応) は、次を追加: Taq 2 マスター ミックス (ニック変換可能) X 25 μ L、プライマー リンカー-Minus450-F の 2.5 μ L (10 μ M、GGGCAAGTTTGTGGAATTGG)、プライマー リンカー-Plus275-R の 2.5 μ L (10 μ M、AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) と 6 μH2o. いいえテンプレート コントロール (NTC) が含まれます。次の条件を使用してたちの反応を孵化させなさい: 1 サイクル (ニック翻訳): 72 ° C、20 分、1 サイクル: 95 ° C、5 分、3 〜 4 サイクル: 95 ° C、15 s、58 ° C、15 s、72 ° C、30 s、1 サイクル: 72 ° C、5 分。 反応クリーンアップ固相リバーシブル固定化ビーズを用いたビーズ比 1:1 のサンプルを実行します。H2O を 40 μ L の溶出します。 さらに目的のフラグメントを増幅 (5′ リンカー + MNase フラグメント +3′ リンカー) 適切な PCR 試薬と次のプライマーを使用して。 PCR マスター ミックスの 12.5 μ L、プライマー リンカー-Minus450-F の 1.25 μ L 使用 (10 μ M、GGGCAAGTTTGTGGAATTGG)、プライマー リンカー-Plus275-R の 1.25 μ L (10 μ M、AAGTGGATCTCTGCTGTCCC)、ステップ 6.4 から精製されたニック翻訳製品の 2.5 μ L。7.5 μ L H2o. の次の条件を使用して、: 1 サイクル: 98 ° C、30 秒、10-16 サイクル: 98 ° C、10 s、63 ° C、10 s、72 ° C、15 s、1 サイクル: 72 ° C 10 分。注: 必要に応じて、いくつかの反応設定できます並列で後続のステップの十分な PCR の製品があることを確認します。Agarose のゲルの PCR の製品の少量を視覚化し、6.5 の手順とその他の反応を設定し、15 から 32 のサイクル数を増やします。この反応は、15 サイクル後 amplicons が表示されない場合、品質管理として使用できます。また、テンプレートなしのコントロール (NTC) が含まれます。 7. サイズ選択 注: この手順 MNase-のフラグメントを分けるに 5′ と 3′ のリンカーを正しく接続された 2 つのフラグメントから 5′ または 3′ リンカー 2 つのサイズに基づいて。 ステップ 6.5 からすべて 15 サイクル PCR の反作用を結合します。 DNA ローディングの染料を追加して、0.8% の agarose のゲルを実行。869 の顕著なバンドを消費税 bp とゲル抽出キットを使用して DNA の浄化します。 (例:分光光度計を使用して) DNA の量を定量化します。 8. クローン gRNA ギブソン アセンブリによって表現のベクトルに PCR 増幅断片の アセンブリの準備マスター ミックスの次のように。メモ: 次の手順は、ギブソンらから適応12。 1 M トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) の 3 mL を組み合わせることにより 6 mL の等温の反作用バッファーを作成-塩酸 pH 7.5、1 M MgCl、100 mM デオキシグアノシン三リン酸 (dGTP) 60 μ L、100 mM デオキシアデノシン三リン酸 (dATP) 60 μ L、100 mM チミジンの 60 μ L 300 μ L三リン酸 (dTTP) 100 mM デオキシシチジン三リン酸 (dCTP) 1 M ジチオトレイトール (DTT)、1.5 g のポリエチレング リコール (PEG)-8000、100 mM ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD) 超純水 H2o. の 300 μ L 300 μ L の 60 μ L注: 検体、-20 ° C で保存されます、このバッファーを使用できます。 5 X の等温の反作用バッファーの 320 μ L、10 U/μ L T5 エキソヌクレアーゼ、2 U/μ L の DNA のポリメラーゼ、40 U/μ L の DNA リガーゼの 5 μ L でアセンブリのマスターの組合せの超純水の H2O を使用 15 μ 160 μ L の 20 μ L の 3 μ L を組み合わせることにより 1.2 mL アセンブリ マスター ミックスを作成します。挿入します。注: アセンブリのマスター ミックス避けようと-20 ° C で保存されます、それは 1 年以上の安定をすることができます、複数凍結融解サイクルを容認することができます。T5 exonuclease の選ばれた量は長いオーバー ハングでの使用に最適です。 ベクター バックボーン消化メモ: 8.3 の手順アセンブリ反応の所望の数の入力としてベクトルの十分な量を消化するを確認します。 反応、1 次を追加:年齢の 1.5 μ L、5 μ L バッファーの gRNA 発現ベクター (pgRNA-pLKO.1) の 1.5 μ g (5 u/μ L)、私と 38.5 μ L H2o ・加温の 2 h の 37 ° C でダイジェストします。 一直線に並べられたベクトルの脱燐酸化。注: この手順はお勧めしますが、厳密には必要ありません。マスター ミックスで T5 exonuclease はほとんど年齢が削除されます私は Taq DNA リガーゼが行動するチャンスがあった前にオーバー ハングします。したがって、ベクトルの過剰な再結紮は想定されていません。 エビのアルカリホスファターゼの酵素 (rSAP、1 U/μ L) の 2.5 μ L を追加します。 37 ° C、30 分インキュベートし、5 分の 65 ° c の孵化によって酵素を不活性化します。 DNA の浄化を実行します。注: agarose のゲルの抽出手順を実行することをお勧めします。代わりに、列またはビードの浄化を使用できます。ベクトル消化が agarose のゲルの電気泳動によって例えば、完全なことを確認することが重要です。比較のため未消化のベクトルを並行して実行する必要があります。 サンプルの精製消化ベクトル量を定量化します。 ベクターに挿入の 2 倍モル過剰を持つアセンブリを設定します。ベクトル (年齢私はステップ 8.5 からダイジェスト) の 20 μ L 反応使用 100 ng あたり 12.2 の ng 挿入手順 7.1。)、8.1.2 の手順アセンブリ マスター ミックスの 15 μ l。H2o. 50 ° C 1 時間インキュベートします。 コラムの浄化を使用して反応を浄化します。H2O の 75 μ L の DNA を再懸濁します (またはエレクトロポレーションの規模に応じてボリュームを適切な)。注: 変換効率は DNA の純度に大きく依存しています。追加精製工程 (例えばフェノール/クロロホルム抽出) は、効率を向上させる可能性があります。 9. エレクトロ有能な TG1大腸菌細胞の調製 すべて遠心分離機の瓶、フラスコ、洗剤洗浄、オートクレーブに入れる前に蒸留水で後続の充填を確認します。注: この手順は、変形の効率に影響を与えるかもしれない不純物を除去するのに役立ちます。水は、使用の直前に破棄する必要があります。また、使い捨て可能な遠心瓶の使用はお勧めできます。 遠心ボトル、チューブ、electrocompetent 細胞の調製に使用されるソリューションは、使用する前に氷に冷え込んでいるを確認します。変形の効率に影響を与えるかもしれない温度の変動を最小限に抑えるため冷蔵室で次の手順を実施することをお勧めします。 2TY メディアを準備します。バクト トリプトンの 16 g に酵母エキスの 10 g と 5 g, 塩化ナトリウムは 1 L、ミックス、オートクレーブに蒸留水を追加します。室温で店中。 2TY 寒天コーティング バイオアッセイ料理と適切な抗生物質を含んでいる 10 cm シャーレを準備します。4 ° C でプレートを保存します。注: 抗菌薬の選択は、pgRNA pLKO.1 の使用 100 μ g/mL アンピシリン gRNA 発現ベクターの性質に依存します。 (抗生物質) なし 2TY 培地 10 mL に接種する TG1 セルのグリセロール ストックからこすり落とします。 225 rpm で振とうしながら 37 ° C 一晩 (~ 16 h) で文化を孵化させなさい。 一晩かけて培養 (1/100 倍希釈液) 10 ml (抗生物質) なし 2TY 培地 1 L を接種して (バッフルを含む) 2 つの 2 L フラスコの間それを均等に分割します。 37 ° c、225 rpm (約 1.5-2 時間) 後 0.55 の OD600 nm に到達するまで文化を孵化させなさい。分光光度計を使用して、OD600 nm を定期的にチェックします。 30 分間氷の上文化を冷やします。 文化 4 500 mL 遠心ボトル (事前冷たい氷の上に均等に分割します。 中古冷蔵遠心分離機で 4 ° C で 4,000 x g で 15 分間遠心します。 培養上清をデカントし、各遠心ボトルにあらかじめ冷やした冷たい滅菌蒸留水 H2O の 1 ボリューム (すなわち 250 mL) を追加します。旋回やボトルを反転する (または穏やかなピペッティング、必要に応じて) は、細菌のペレットを再懸濁します。注: それは最初に少量の水を追加することでペレットを再懸濁しますやすくなっています。ペレットは完全に最終的に再停止されるを確認します。 4 ° C で 4,000 x g で 15 分遠心分離 2 回、洗浄を繰り返します (手順 9.12。 9.13 と)。上澄みを除去します。デカント細菌ペレット洗浄後ますますルーズになるよう注意してください。 滅菌、氷冷 10% グリセロールの 50 mL にペレットを再懸濁し、中古冷蔵 50 mL の遠心管にそれを転送します。 4 ° C の ~ 4,000 x g で 15 分遠心分離細胞上清を慎重に取り外します。 優しく冷たい滅菌 10% グリセロール 2 mL 中の細菌を再懸濁します。 セルがすぐにエレクトロポレーションを使用する氷の上保管してください。注: セル ドライアイス ・ エタノールお風呂で 0.5 mL チューブに 50 μ L の因数で冷凍でき-80 ° C で保存、これは推奨されません。 10. TG1 Electrocompetent大腸菌細胞のエレクトロポレーション 注: エレクトロポレーション、包括的なライブラリを生成のボトルネックの一つです。ライブラリ表現を維持するために必要な/実行可能な多くの個々 のエレクトロポレーション反応を実施して以下の品質管理手順を実行するお勧め (10.6。 と 10.8。)。 滅菌済みチルド PCR に (手順 8.8) から精製反応管の因数と氷 (チューブあたり 1 μ L) のそれらを保ちます。氷の上の 1 mm のギャップ エレクトロポレーション キュベットを冷やします。 DNA の 1 つの因数に直接作りたての TG1 細胞の 25 μ L を追加し、すぐにエレクトロポレーション キュベットに混合物を転送します。フリックやタップ細胞・ DNA ミックスを確保するためのキュベットは (閉じ込められた空気や泡) を持たないキュベット チャンバーの長さに沿って配られます。 スライド室のキュヴェットを配置し、適切なエレクトロポレーション プログラムを起動 (1.8 の例えば 1 パルス kV (EC1))。注: 時定数は、5.7 および 6.0 さん間にある必要がありますいる場合遺伝子導入装置アーク キュヴェットをフリック、商工会議所に気泡がないことを確認もう一度やり直してください。 すぐにキュヴェットに室温 2TY 媒体の 975 μ L を追加します。 Electroporated 細菌を 50 mL チューブに移動転送ピペットを使用して、します。10.2 のステップからを繰り返します。1 つ 50 mL のチューブの 1 つのライブラリに変換のすべてのセルを収集しています。 総量を文書化します。 品質管理手順 新たに生成された電子有能なセルの能力を定量化するには、ノーカット プラスミド DNA (例えば 10 pg pUC19 の制御プラスミド) の定義された数量を使用して別のエレクトロポレーション反応を実行します。これを 1.5 mL および microfuge の管に転送します。注: 能力は少なくとも 1010コロニー形成単位 (cfu) μ g の DNA をする必要があります。常に新鮮な細胞は通常これより実行します。 225 rpm で 60 分の 37 ° C で変換された細菌を孵化させなさい。 品質管理手順: 適切な抗生物質の選択と 10 cm 寒天プレート上のライブラリ (例えば10 μ L の 10-100 倍希釈) を細菌の定義された少量のプレート。注: は、(ステップ 10.6) から合計文化量を知ること、得られたコロニー数はライブラリ全体のコロニーの総数を推定する使用できます。ライブラリの 20-30 倍の表現を維持理想的にする必要があります。 適切な抗生物質の選択範囲を含む 2TY コーティング寒天生物検定料理に細菌の残りの部分を分散させます。注: ~ 4,000 x g で 10 分間 (または表示ペレットを形成して上澄みがはっきり表示されるまで) での遠心分離によって文化の量を削減できます。これは、プレートが文化の広がり後に乾燥する必要があります時間を短縮します。液体培養ではなく、板の使用は、個々 のコロニーの肥大化を最小化します。13 適切な抗生物質の選択と追加 10 cm 寒天培地皿に pUC19 コントロール エレクトロポレーション反応の適切な量を広げます。 寒天一晩 (16 h) 37 ° c. で孵化させなさい ライブラリの複雑さだけでなく、細菌の CFU/μ g の DNA を推定する制御板 (pUC19 とコントロール ライブラリ プレート) の得られたコロニーをカウントします。 11. プラスミッド DNA の抽出 一晩のプレートに 2 TY メディアの 10 mL を追加、細菌層をオフに使い捨てスプレッダーを使用してプレートをこすり、50 mL のチューブで収集します。きれいなプレートのすべて表示されるまでに数回を繰り返します。 (2-3 列必要なバイオアッセイあたりプレート) プラスミド マキシ キットを使用して DNA を抽出します。