Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

(1) Verdauung der DNA mit Micrococcal Nuclease Führen Sie eine Optimierung Reaktion für jede neue Charge micrococcal Nuklease Enzyms (MNase).Hinweis: Die Anzahl der Einheiten des MNase verwendet sollte (über eine serielle Verdünnung, Abb. 2A) getestet werden. In der Regel 5-10 U MNase verdauen 1 µg der genomischen gereinigt oder BAC DNA auf einem Bereich von 5 bis 100 bp mit den Bedingungen beschrieben. Pro Reaktion, 1 µL 10 x MNase Buffer, 1 x Rinderserumalbumin (BSA), 1 µg der Ziel DNA, 1 µL MNase eingerichtet (0,1-50 Einheiten) in einer 10 µL Reaktionsvolumen. Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten. Sofort inaktivieren das Enzym durch Zugabe von 1 µL von 500 mM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-Tetraacetic Säure (EGTA). 2. Trennung von DNA-Fragmenten mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Fügen Sie Probe Puffer/Gel laden Farbstoff für DNA-Proben und laden auf eine 20 % Seite Gel. Laden Sie eine entsprechende DNA-Leiter für die Dimensionierung (5 bp DNA-Leiter). Überlasten Sie nicht das Gel (1 µg DNA pro Well). Laufen Sie Gele für bp, erreicht das untere Ende des Gels, um 1,5 h oder bis die untere Farbstoff-Front (Bromophenol blau, dunkel blau), die bei etwa 15 fährt in entsprechenden 1 X TRIS-Borat-EDTA (TBE) laufenden Puffer 150 V (konstante). Das Gel mit einer ultra-sensitive Nukleinsäure-Fleck Fleck und unter UV-Licht zu visualisieren. Bestimmen Sie aus dem Gelbild die optimale Konzentration der MNase verdauen DNA bis zu 20-30 bp in der Größe. Verwenden Sie die optimierten Konzentration von MNase Ziel DNA zu verdauen, durch Wiederholen der Schritte 1,2-2,2. In der Regel verdaut, Einrichten von 10-12, die Reaktionen (d.h. 10-12 µg der gesamten Ausgangsmaterial) genug erbringt DNA nach Seite Gel Extraktion, um mit weiteren Schritten fortfahren. Mit einem sterilen Skalpell, schneiden Sie das Gel neben der Marker-Spur und färben Sie nur den Teil des Gels mit der Leiter mit frischen 1 X TBE laufenden Puffer mit 1 X ein hochempfindliches Nukleinsäure-Fleck. Visualisieren Sie die DNA-Leiter und Verbrauchsteuern Sie MNase verdaut DNA-Fragmente in der Größenordnung zwischen etwa 18-30 bp mit einer Rasierklinge.Hinweis: Aussetzen Sie die MNase verdaut Fragmente mit UV-Licht. “Es ist möglich, verwenden Sie eine blaue Lichtquelle (statt UV) oder nehmen ein Bild der Leiter unter UV, drucken Sie es zu skalieren und verwenden Sie diese Option, um Exzision der MNase verdaut DNA-Fragmente zu führen). Dieser Schritt verhindert Fleckenbildung und DNA-Fragmente Exposition gegenüber UV-Licht. Verwenden Sie immer eine ungenutzte, sterile Einweg Skalpell oder einer Rasierklinge für diesen Schritt, um Verunreinigungen zu vermeiden. Übertragen Sie die Gel-Scheibe zu einem Microcentrifuge Schlauch. Flecken auf den Rest des Gels mit Nukleinsäure-Fleck als oben, UV-Licht aussetzen und zeichnen ein Bild, um das Gel Exzision Schritt aufzeichnen. 3. Isolation von DNA-Fragmenten aus Seite-Gele mit Crush und Einweichen Methode Hinweis: Dieser Schritt wurde von Sambrook Et Al. übernommen 11 Bereiten Sie Seite Gel Solubilisierung Puffer (1,88 mL Ammoniumacetat 4 M, 150 µL 1 M Magnesium-Acetat, 30 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (pH 8) in hochreinen H2O auf ein Gesamtvolumen von 15 mL). Zerdrücken Sie die ausgeschnittenen Gel Scheibe gegen die Wand der Mikro-Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Pipettenspitze. Fügen Sie 2 Bände der Seite Solubilisierung Puffer gel und Inkubation bei 37 ° C 16 h auf einer rotierenden Plattform hinzu. Zentrifugieren Sie Proben für 1 min bei maximaler Geschwindigkeit in einem Microcentrifuge. Übertragen des Überstands zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch, kümmert sich nicht um irgendwelche Stücke zerkleinert Gel zu übertragen. Hinzufügen von 0,5 Volumen der Seite Solubilisierung Puffer auf das Gel Pellets, Wirbel, und wiederholen Sie die Zentrifugation (Schritt 3.4). Kombinieren Sie die Überstände. Die DNA-Fragmente über standard Phenol-Chloroform Extraktion zu extrahieren.Achtung: Phenol ist giftig bei Kontakt mit Haut oder beim Verschlucken. Sicherheitsvorkehrungen wie Handschuhe, Schutzbrille, einen Laborkittel und arbeiten in einer Dampfhaube sind entscheidend. Alle Phenol-haltige Abfälle des Instituts vorschriftsmäßig entsorgen. Hinzu kommen ein Volumen von Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1) der Probe und Wirbel gründlich. Zentrifuge für 10 min. bei maximaler Geschwindigkeit (16.000 x g) in einer Tischplatte Zentrifuge bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die oberen wässrige Phase sorgfältig auf einen frischen Microcentrifuge Schlauch. Achten Sie darauf, nicht über irgendwelche Phenol beim Pipettieren tragen. Wiederholen Sie die Schritte 3.6.1 und 3.6.2 einmal. Fügen Sie eine kleine Menge (0,2 µL) von Glykogen, 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2 Bände von 100 % Ethanol (EtOH). Wirbel und Inkubation bei-20 ° C für mehrere Stunden oder über Nacht. Zentrifuge für 30 min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 ° C mit einer Tischplatte Zentrifuge. Nehmen Sie den Überstand vorsichtig und waschen das DNA-Pellet mit 70 % EtOH. Zentrifuge für 30 min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 ° C mit einer Tischplatte Zentrifuge. Entfernen Sie den Überstand zu und trocknen Sie das DNA-Pellet. Stellen Sie sicher, dass alle EtOH verdampft ist, aber achten Sie darauf, das Pellet übermäßig trocken. Auflösen von DNA-Pellet in 12 µL H2O.Hinweis: Seite Gel Extraktion ist sehr ineffizient. Erwarten Sie für jede 10 µg DNA mit MNase verdaut zu starten, ng 1-20 von gereinigten Fragmenten nach Gel Extraktion zu erholen. Betrag und die Integrität der Fragmente durch Laden von 1/6th Steuern (2 µL) auf einer Seite Gel (Abbildung 2). 4. Ende Reparatur MNase verdaut, Gel-gereinigte Fragmente Richten Sie die folgende Reaktion unter Verwendung einer DNS Abstumpfung Kit: 10 µL gereinigte DNA aus Schritt 3.6.10, 1,5 µL 10 X Abstumpfung, Puffer, 1,5 µL 1 mM dNTP-Mix, 0,6 µL abstumpfen Enzym, 1,4 µL H2O. Bei 22 ° C für 30 min inkubieren Sie, und dann inaktivieren Sie Hitze-das Enzym durch Inkubation bei 70 ° C für 10 Minuten. Fügen Sie 85 µL H2O und durchführen einer Reaktion Sanierung mit standard Phenol/Chloroform-Extraktion und EtOH-Niederschlag (siehe Abschnitt 3.6). Fahren Sie sofort mit Linker Ligatur. (5) Linker Generation Hinweis: Linker müssen parallel zu Abschnitt 3 sofort mit Linker Ligatur fortfahren können verstärkt werden. Primer-Sequenzen, die unten verwendet müssen für den gewählten gRNA Expressionsvektor geeignet sein. Die hier vorgestellten wurden für die Vektor-PgRNA-pLKO.1 entwickelt. Verwenden Sie 9 zur Verstärkung der 5′ Linker aus PgRNA-pLKO.1, die Grundierung Sequenzen 5′-Linker-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) und 5′-Linker-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), ein 689 bp Amplikons nachgeben. Zur Verstärkung der 3′ Linker aus PgRNA-pLKO.1 verwenden Sie die Primer 3′-Linker-f: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) und 3′-Linker-R: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), die eine 848 bp Amplikons Ausbeute. PCR-verstärken Sequenzen der Adapter aus dem gRNA Ausdruck Vektor (mit Reagenzien und benutzerdefinierte Primer-Sequenzen, wenn nötig). Für PgRNA-pLKO.1 eingerichtet, die folgenden 50 µL-PCR-Reaktion: 25 µL des PCR-master-Mix, 2,5 µL Grundierung F (10 µM), 2,5 µL Grundierung R (10 µM), 0,1 ng gRNA Expressionsvektor (PgRNA-pLKO.1) in H2O. Inkubieren Sie Reaktionen auf einem Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 1 Zyklus 98 ° C für 30 s, 32 Zyklen 98 ° C für 10 s, 59 ° C für 10 s, 72 ° C für 30 s, 1 Zyklus 72 ° C für 10 Minuten. PCR-Reaktionen, die unter Verwendung der Festphase reversible Immobilisierung Korne entsprechend den Anweisungen des Herstellers zu reinigen. Eluieren Sie in 30 µL von H2O. Direktionale Ligatur der Linker den Ende repariert, MNase verdaut DNA-Fragmenten, Digest linker mit geeigneten Restriktionsenzymen (hier HindIII und SacII) durchzusetzen. Richten Sie die folgenden Reaktionen: Für die Verdauung von 5′ Linker mit HindIII, 30 µL des gereinigten 5′ Linker Amplikons aus Schritt 5.3 verwenden., 5 µL Puffer, 3 µL HindIII (20U/µL) und 12 µL H2O. Für die Verdauung von 3′ Linker mit SacII, 30 µL des gereinigten 3′ Linker Amplikons aus Schritt 5.3 verwenden., 5 µL Puffer, 3 µL des SacII (20 U/µL) und 12 µL H2O. Inkubieren Sie Übersichten bei 37 ° C für 3 h. Fügen Sie DNA-Gel laden Farbstoff hinzu und führen Sie das Restriktionsenzym verdaut auf einem 1 % Agarose-Gel. Verbrauchsteuern die Bänder an 637 bp (5′ Linker “Digest”) und 295 bp (3′ Linker “Digest”). Reinigen Sie die DNA aus den ausgeschnittenen Gel mit einem Gel Extraction Kit. 6. Linker Ligation und Verstärkung der Einsätze Richten Sie eine 14 µL Ligatur Reaktion unter Verwendung der äquimolaren Mengen an MNase verdaut, Ende repariert Fragmente und Linker Sequenzen.Hinweis: Linker Fragment-Verhältnisse kann optimiert werden. Es wird empfohlen, eine Kontrollreaktion keine-Fragment (NFC) enthalten. Verwendung 5 ng MNase verdaut Fragmente (Ende repariert und gereinigt), 120 ng von 5′ Linker (HindIII “Digest”, gereinigt), 55 ng 3′ Linker (SacII “Digest”, gereinigt), 1,4 µL T4-Ligase Puffer und 1,4 µL konzentrierte T4 DNA-Ligase in H2O. Inkubieren Sie die Ligatur Reaktionen bei 16 ° C 16 h. Tun nicht Hitze-inaktivieren das Enzym. Gehen Sie sofort zum Nick-Übersetzung.Hinweis: Die Ende repariert MNase verdaut Fragmente bieten die 5′-Phosphate notwendig für die Unterbindung der Linker, als Linker selbst un-phosphorylierten sind. Zu der Ligatur Reaktion (und die NFC-Reaktion) fügen Sie die folgenden: 25 µL Taq 2 X master-Mix (kann Einschnittübersetzung), 2,5 µL Grundierung Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2,5 µL Grundierung Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) und 6 µL H2O. Eine keine-Template-Kontrolle (NTC) gehören. Inkubieren Sie Reaktionen auf einem Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 1 Zyklus (Nick Übersetzung): 72 ° C für 20 min, 1 Zyklus: 95 ° C für 5 min, 3-4 Zyklen: 95 ° C für 15 s, 58 ° C für 15 s, 72 ° C für 30 s, 1 Zyklus: 72 ° C für 5 Minuten. Führen Sie eine Reaktion Säuberung unter Verwendung der Festphase reversible Immobilisierung Korne mit einer Probe Wulst-Verhältnis von 1:1. Eluieren Sie in 40 µL von H2O. Weiter verstärken das gewünschte Fragment (5′ Linker + MNase fragment + 3 “Linker) mit entsprechenden PCR Reagenzien und die folgenden Primer: Verwenden Sie 12,5 µL des PCR-master-Mix, 1,25 µL Grundierung Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1,25 µL Grundierung Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 2,5 µL des gereinigten Nick Übersetzung Produkt aus Schritt 6.4. und 7,5 µL H2O. verwenden Sie die folgenden Bedingungen: 1 Zyklus: 98 ° C für 30 s, 10-16 Zyklen: 98 ° C für 10 s, 63 ° C für 10 s, 72 ° C für 15 s, 1 Zyklus: 72 ° C für 10 Minuten.Hinweis: Bei Bedarf können mehrere Reaktionen gleichzeitig eingerichtet werden um sicherzustellen, dass es genug PCR-Produkt für die nachfolgenden Schritte. Um kleine Mengen an das PCR-Produkt auf einem Agarosegel zu visualisieren, richten Sie zusätzliche Reaktionen wie in Schritt 6.5 und erhöhen Sie die Anzahl der Zyklus von 15 bis 32. Diese Reaktion kann als Qualitätskontrolle, verwendet werden, wenn Amplifikate nach 15 Zyklen nicht sichtbar sind. Gehören Sie auch eine keine Vorlage Kontrolle (NTC). 7. die Größenauswahl Hinweis: Dieser Schritt trennt MNase-Fragmente mit dem korrekt angeschlossenen 5′ und 3′-Linker aus Fragmenten mit zwei 5′ oder zwei 3′ linker basierend auf Größe. Kombinieren Sie alle 15-Zyklus-PCR-Reaktionen aus Schritt 6.5., DNA loading Dye hinzufügen und ausführen auf einem 0,8 % Agarose-Gel. Verbrauchsteuern die prominenten Band auf 869 bp und DNA mit einem Gel Extraction Kit zu reinigen. Die Menge von DNA (z. B. mit einem Spektralphotometer) zu quantifizieren. 8. das Klonen der PCR verstärkt Fragmente in der gRNA Expressionsvektor von Gibson Versammlung Bereiten Sie Baugruppe meistern Mischung wie folgt:Hinweis: Die folgenden Schritte sind von Gibson Et al. 12. 6 mL isothermen Reaktion Puffer zu schaffen, durch die Kombination von 3 mL 1 M Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris)-HCl pH 7.5, 300 µL 1 M MgCl, 60 µL 100 mM Deoxyguanosine Triphosphat (dGTP), 60 µL 100 mM Deoxyadenosine Triphosphat (dATP), 60 µL 100 mM Deoxythymidine Triphosphat (dTTP), 60 µL 100 mM Deoxycytidine Triphosphat (dCTP), 300 µL 1 M Dithiothreitol (DTT), 1,5 g Polyethylenglykol (PEG)-8000, 300 µL 100 mM Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NAD) in hochreinen H2O.Hinweis: Dieses Puffers kann regelmÄÑig und bei-20 ° c gelagert werden Erstellen Sie durch die Kombination 320 µL 5 X isothermen Reaktion Puffer, 3 µL 10 U/µL T5 Exonuclease, 20 µL 2 U/µL DNA-Polymerase, 160 µL 40 U/µL DNA Ligase in hochreinen H2O. Einsatz 15 µL Montage-master-Mix mit 5 µL 1,2 mL-Montage-master-mix Fügen Sie ein.Hinweis: Die Montage-master-Mix kann regelmÄÑig und bei-20 ° C gelagert wo ist es seit mehr als einem Jahr stabil und verträgt mehrere Gefrier-Tau-Zyklen. Der gewählte Betrag von T5 Exonuclease ist ideal für den Einsatz mit langen Überhängen. Vektor Rückgrat VerdauungHinweis: Stellen Sie sicher, eine ausreichende Menge des Vektors als Input für die gewünschte Anzahl der Montage Reaktionen im Schritt 8.3 zu verdauen. Pro Reaktion, fügen Sie die folgenden: 1,5 µg gRNA Expressionsvektor (PgRNA-pLKO.1), 5 µL Puffer, 1,5 µL altich (5U/µL) und 38,5 µL H2O. Incubate verdauen bei 37 ° C für 2 h. Dephosphorylation der linearisierten Vektor.Hinweis: Dieser Schritt ist beraten, aber nicht unbedingt notwendig. T5 Exonuclease in den master-Mix werden meist entfernen Alterich Überhänge, bevor die Taq-DNA-Ligase eine Chance zum handeln konnte. Übermäßige Re Unterbindung des Vektors ist daher nicht zu erwarten. Fügen Sie 2,5 µL Shrimp alkalische Phosphatase Enzym (rSAP, 1 U/µL). Inkubation bei 37 ° C für 30 min und dann inaktivieren das Enzym durch Inkubation bei 65 ° C für 5 Minuten. DNA-Reinigung durchführenHinweis: Es wird empfohlen, ein Agarose-Gel-Extraktionsschritt durchführen. Alternativ kann die Spalte oder Perlen Reinigung verwendet werden. Es ist wichtig zu prüfen, ob die Vektor-Verdauung abgeschlossen, z. B. durch Agarose-Gelelektrophorese ist. Zum Vergleich sollte unverdaute Vektor parallel ausgeführt werden. Die Höhe der gereinigten verdauten Vektor in der Probe zu quantifizieren. Die Montage mit 2-fold Molaren Überschuss an Einsätzen für Vektor-eingerichtet. Pro 20 µL Reaktion Verwendung 100 ng des Vektors (Alterich aus Schritt 8,5 verdauen), 12.2 ng von einfügen (ab Schritt 7.1.), 15 µL des Montage-master-Mix aus Schritt 8.1.2. H2O. Bei 50 ° C für 1 h inkubieren. Reinigen Sie die Reaktionen mit Spalte Reinigung. Aufschwemmen die DNA in 75 µL H2O (oder entsprechende Lautstärke je nach Ausmaß der Elektroporation).Hinweis: Die Transformationseffizienz ist stark abhängig von DNA Reinheit. Weitere Reinigungsschritte (z.B. Phenol/Chloroform Extraktion) könnte die Effizienz erhöhen. 9. Vorbereitung der Electro-kompetente TG1 E. Coli Zellen Stellen Sie sicher, dass alle Flaschen Zentrifuge und Korbflaschen frei von Reinigungsmitteln durch Spülen und anschließende Füllung mit destilliertem Wasser vor dem Autoklavieren sind.Hinweis: Dieser Schritt hilft, um eventuelle Verunreinigungen zu entfernen, die Transformationseffizienz zu beeinträchtigen. Wasser sollte unmittelbar vor dem Gebrauch entsorgt werden. Alternativ kann die Verwendung von Einweg-Zentrifugation Flaschen ratsam sein. Sicherstellen Sie, dass die Zentrifuge Flaschen, Tuben und Lösungen für die Herstellung von Electrocompetent Zellen auf Eis vor dem Gebrauch gekühlt werden. Es empfiehlt sich, führen die folgenden Schritte in einem kalten Raum Temperatur-Schwankungen zu minimieren, die die Transformationseffizienz beeinträchtigen können. Bereiten Sie 2TY Medium. 16 g Bacto Tryptone hinzufügen Hefeextrakt 10 g und 5 g NaCl, destilliertes Wasser, 1 L, Mix und Autoklaven. Speicher Medium bei Raumtemperatur. Bereiten Sie 2TY-Agar beschichtet Bioassay Gerichte und 10 cm Petrischalen mit dem entsprechenden Antibiotikum. Platten bei 4 ° c lagernHinweis: Die Wahl des Antibiotikums richtet sich nach der Art des Expressionsvektors gRNA, Einsatz 100 µg/mL Ampicillin für PgRNA-pLKO.1. Kratzen Sie aus einem Glycerin-bestand der TG1 Zellen 10 mL 2TY Medium (ohne Antibiotika) zu impfen. Inkubieren Sie Kultur bei 37 ° C über Nacht (~ 16 h) mit Schütteln bei 225 u/min. 1 L 2TY Medium (ohne Antibiotika) mit 10 mL der Übernacht-Kultur (1/100 Verdünnung) zu impfen und zwei 2 L Flaschen (mit Schikanen) gleichmäßig verteilen. Inkubieren Sie Kultur bei 37 ° C 225 u/min bis ein OD600 nm von 0,55 (nach ca. 1,5-2 h) erreicht ist. Verwenden Sie ein Spektralfotometer um OD600 nm, regelmäßig zu überprüfen. Chill-Kulturen für 30 min auf Eis. Die Kultur gleichmäßig auf vier 500 mL Zentrifuge Flaschen (Pre auf Eis gekühlt) aufgeteilt. Zentrifuge für 15 min bei 4.000 x g bei 4 ° C in einer Zentrifuge vorgekühlt. Dekantieren Sie Überstände und jeder der Zentrifuge Flaschen fügen Sie 1 Volumen (z.B. 250 mL) von vorgekühlt eiskalte sterilem destilliertem H2O hinzu. Aufschwemmen der bakteriellen Pellets von Wirbeln oder Umkehrung der Flaschenhals (oder sanfte pipettieren, falls erforderlich).Hinweis: Es ist einfacher, das Pellet Aufschwemmen von zunächst eine kleine Menge Wasser hinzufügen. Sicherstellen Sie, dass die Kugel schließlich vollständig Nukleinsäuretablette ist. Zentrifuge für 15 min bei 4.000 x g bei 4 ° C. Die Wäsche zwei Mal wiederholen (Schritte 9.12. und 9.13). Den Überstand zu entfernen. Seien Sie vorsichtig beim Umfüllen, da die bakterielle Pellet nach dem Waschen immer locker wird. Das Pellet in 50 mL steril, eiskalte 10 % Glycerin Aufschwemmen und überträgt es auf eine Pre-gekühlte 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge Zellen für 15 min bei ~ 4.000 x g bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den überstand. Sanft Aufschwemmen der Bakterien in 2 mL eiskaltes sterile 10 % Glycerin. Halten Sie auf Eis, wenn die Zellen sofort für Elektroporation eingesetzt werden sollen.Hinweis: Die Zellen können in Aliquote von 50 µL in 0,5 mL Röhrchen in ein Trockeneis Ethanol Bad eingefroren und bei-80 ° C gelagert, aber dies wird nicht empfohlen. 10. die Elektroporation TG1 Electrocompetent E. Coli Zellen Hinweis: Elektroporation ist eines der Engpässe in umfassenden Bibliothek Generation. Um die Bibliothek Darstellung zu erhalten, wird empfohlen, möglichst viele individuelle Elektroporation Reaktionen wie nötig/möglich durchzuführen und führen Sie die unten beschriebenen Schritte der Qualitätskontrolle (10.6. und 10.8.). Aliquoten gereinigten Reaktionen (aus Schritt 8,8) steril und vorgekühlt PCR tubes und halten sie auf dem Eis (1 µL pro Röhre). 1 mm Spalt Elektroporation Küvetten auf Eis abkühlen. Fügen Sie 25 µL des frisch zubereiteten TG1 Zellen ein Aliquot der DNA direkt hinzu und sofort übertragen Sie die Mischung in eine Küvette Elektroporation. Streichen Sie oder tippen Sie auf die Küvette um sicherzustellen, dass die Zellen/DNA-Mischung über die Länge der Küvette Kammer (ohne Lufteinschlüsse oder Bläschen) verteilt wird. Legen Sie die Küvette in die Folie Kammer und starten Sie das entsprechende Elektroporation-Programm (z. B. 1 Impuls von 1,8 kV (EC1)).Hinweis: Die Zeitkonstante sollte zwischen 5,7 und 6.0 Frau liegen, für den Fall, dass der Electroporator Bögen, streichen Sie die Küvette, sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Kammer und versuchen Sie es erneut. Fügen Sie 975 µL Raumtemperatur 2TY Medium sofort die Küvette hinzu. Mit einer Transferpipette, bewegen Sie die elektroporiert Bakterien, eine 50 mL-Tube. Wiederholen Sie ab Schritt 10.2. und sammeln Sie alle Zellen mit einer Bibliothek in eine 50 mL Tube transformiert. Das Gesamtvolumen zu dokumentieren. Qualitätskontrolle-Schritt Um die Kompetenz der frisch erzeugten Elektro-kompetente Zellen zu quantifizieren, führen Sie eine separate Elektroporation Reaktion mit einer definierten Menge ungeschnitten Plasmid DNA (z. B. 10 Pg pUC19 Kontrolle Plasmid). Auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen.Hinweis: Die Kompetenz sollte mindestens 1010 Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro µg DNA. Frisch zubereitete Zellen führen in der Regel besser als dieser. Inkubieren Sie transformierte Bakterien bei 37 ° C für 60 min schütteln bei 225 u/min. Qualitätskontrolle-Schritt: Platte eine definierte kleine Menge von Bakterien, die mit der Bibliothek (z. B. 10 µL einer 10-100 fache Verdünnung) auf einen 10 cm Agarplatte mit den entsprechenden Antibiotika Auswahl umgewandelt.Hinweis: Kenntnis der gesamten Kulturvolumen (ab Schritt 10.6.), die Anzahl der erhaltenen Kolonie lässt sich die Gesamtzahl der Kolonien für die gesamte Bibliothek zu schätzen. 20-30 fache Darstellung der Bibliothek sollte im Idealfall beibehalten werden. Verteilen Sie den Rest der Bakterien auf 2TY Agar beschichtet Bioassay Speisen mit der geeigneten Antibiotika-Auswahl.Hinweis: Die Lautstärke der Kultur kann durch Zentrifugation bei ~ 4.000 x g für 10 min (oder bis ein sichtbarer Pellet gebildet hat und der Überstand klar scheint) reduziert werden. Dies reduziert die Zeit, die Platten nach der Verbreitung der Kultur trocknen müssen. Verwendung von Platten statt Flüssigkultur minimiert überproportionales Wachstum der einzelnen Kolonien. 13 Einem entsprechenden Volumen der pUC19 Kontrolle Elektroporation Reaktion auf eine zusätzliche 10 cm-Agar-Teller mit geeigneten Antibiotika Auswahl zu verbreiten. Inkubieren Sie Agarplatten über Nacht (16 h) bei 37 ° c Zählen Sie erhaltenen Kolonien auf den Steuerplatten (pUC19 und Kontrolle-Bibliothek-Platte), KBE/µg DNA für die Bakterien zu schätzen sowie Bibliothek Komplexität. 11. die Gewinnung von Plasmid DNA Die Übernachtung Platten 10 mL 2-TY Medien hinzu, kratzen Sie die bakterielle Schicht aus der Platte mit einem Einweg-Spreader und sammeln sie in einem 50 mL-Tube. Wiederholen Sie ein paar Mal, bis alle der Platte erscheint sauber. Extrahieren Sie DNA mit einem Plasmid Maxi-Kit (2-3 Spalten benötigt pro Bio-Assay Tafel).