一种从任意 DNA 源进行大规模 gRNA 库生产的通用协议

1. Micrococcal 核酸的 DNA 消化 对每一个新的 micrococcal 核酸酶 (MNase) 进行优化反应。注: 使用的 MNase 的单位数应进行测试 (使用串行稀释,图 2A)。通常, 5-10 ü MNase 消化1µg 纯化基因组或 BAC DNA 下降到 5-100 bp 的范围, 下面描述的条件。 每反应, 建立了1µL 的 10x MNase 缓冲, 1x 牛血清白蛋白 (BSA), 1 µg 的目标 DNA, 1 µL MNase (0.1-50 单位) 在10µL 反应体积。 孵育在37° c 为15分钟。 立即钝化酶, 加入1µL 500 毫米乙二醇双 (β-氨基乙基醚)-n, n, n, n-‘, 乙酸酸 (EGTA)。 2. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 DNA 片段 (页) 添加样本缓冲/凝胶加载染料的 DNA 样本和负载到一个20% 页的凝胶。为上浆 (5 bp dna 阶梯) 加载合适的 dna 阶梯。不要使凝胶 (每井1µg DNA) 过载。 运行凝胶在适当的1x 三硼酸盐-EDTA (无) 运行缓冲在 150 V (恒定) 为大约 1.5 h 或直到更低的染料前面 (溴蓝色, 深蓝颜色) 旅行在大约 15 bp, 到达胶凝体的更低的末端。 使用超灵敏的核酸染色和 UV 光下的可视化来着色凝胶。 从凝胶图像, 确定最佳浓度的 MNase 消化 DNA 下降到 20-30 bp 的大小。 通过重复步骤 1.2-2.2, 使用 MNase 的优化浓度来消化目标 DNA。通常, 设置10-12 反应 (即10-12 µg 的总起始材料) 将产生足够的消化 DNA 后, 页凝胶提取, 以进行后续步骤。 使用无菌手术刀, 切割在标记车道旁边的凝胶, 并只对含有该阶梯的凝胶部分进行染色, 新的1x 的运行缓冲含有1X 的超灵敏核酸染色。可视化的 dna 阶梯和消费 MNase 消化 dna 片段的大小范围内约 18-30 bp 使用刀片。注意: 避免将 MNase 消化的碎片暴露在 UV 光中。它可以使用蓝色光源 (而不是 uv) 或采取在紫外线下的梯子的图像, 打印它的规模, 并使用它来指导切除 MNase 消化的 DNA 片段)。这一步避免了染色和暴露的 DNA 片段, 以紫外光。在这一步中, 总是使用无菌的一次性手术刀或刀片, 以避免污染。 将凝胶切片转移到离心管。 染色的其余部分的凝胶与核酸染色如上所述, 暴露在紫外线和记录一个图像, 以保持一个记录的凝胶切除步骤。 3. 用粉碎和浸泡法分离页凝胶中的 DNA 片段 注意: 此步骤已从理查德·山姆布鲁克et al.中采用11 准备页面凝胶增溶缓冲剂 (1.88 毫升4米醋酸铵, 150 µL 1 米醋酸镁, 30 µL 0.5 米乙酸酸 (EDTA) (pH 8) 在超纯 H2O 到总容量15毫升)。 使用无菌吸管尖端将切除的凝胶片粉碎到微离心管的壁上。 在旋转平台上加入2页增溶缓冲剂, 在37° c 下孵育16小时。 在离心中以最大速度离心样品1分钟。把上清液转移到一个新的离心管, 注意不要转移任何粉碎的凝胶件。 增加0.5 卷的页面增溶缓冲剂的凝胶颗粒, 涡旋, 重复离心 (步骤 3.4)。结合清。 用标准的苯酚-氯仿萃取提取 DNA 片段。注意: 如果与皮肤接触或吞食, 苯酚是有毒的。安全预防措施, 如手套, 防护眼镜, 实验室大衣, 并在通风罩工作是至关重要的。根据研究所的规定处理所有含酚废物。 将一卷 phenol:chloroform:isoamyl 醇 (25:24:1) 添加到样品和涡流中。 在室温下的台式离心机中, 离心机的最大转速为10分钟 (1.6万 x g)。小心地将上部水相转移到新鲜的离心管。注意不要在移期间携带任何苯酚。 重复步骤3.6.1 和3.6.2 一次。 添加少量 (0.2 µL) 的糖原, 0.1 卷3米醋酸钠 (pH 5.2) 和2卷100% 乙醇 (乙醇)。 漩涡和孵化在-20 ° c 几个小时或过夜。 用台式离心机在4° c 的最大转速下离心30分钟。 小心去除上清液, 用70% 乙醇清洗 DNA 颗粒。 用台式离心机在4° c 的最大转速下离心30分钟。 除去上清和风干的 DNA 颗粒。确保所有的乙醇已蒸发, 但小心不要过度干燥的颗粒。 在12µL 的 H2O 中溶解 DNA 颗粒。注: 页面凝胶提取是非常低效的。每10µg 开始 DNA 消化 MNase, 预期恢复 1-20 ng 纯化后的凝胶提取物。通过在页面凝胶上加载 1/6th (2 µL) 来控制碎片的数量和完整性 (图 2C)。 4. MNase 的末端修复, 凝胶纯化的碎片 使用 DNA 钝化试剂盒建立以下反应:10 µL 的纯化 dna 从步骤 3.6.10, 1.5 µL 的10X 钝化缓冲, 1.5 µL 1 毫米 dNTP 混合, 0.6 µL 钝化酶, 1.4 µL 的 H2O。 孵育在22° c 为30分钟, 然后加热-钝化酵素在70° c 为 10 min。 添加85µL 的 H2O, 并使用标准苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀 (如3.6 节所述) 执行反应清洁。立即进行连结器结扎。 5. 链接器生成 注意: 连接需要与3节并行放大, 以便能够立即进行连接器结扎。下面使用的引物序列必须适合于所选的 gRNA 表达载体。这里介绍的是为矢量 pgRNA-pLKO 1。9为放大 5 “连接器从 pgRNA-pLKO 1, 使用底漆序列 5”-链接器 F (TTGGAATCACACGACCTGGA) 和 5 ‘-链接器 R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), 产生 689 bp 增。为放大 3 ‘ 连接器从 pgRNA-pLKO 1, 使用底漆 3 ‘-连接器 F: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) 和 3 ‘-链接器 R: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), 产生 848 bp 增。 PCR-放大适配器序列从 gRNA 表达载体 (使用选择试剂和自定义引物序列, 如果需要)。为 pgRNA-pLKO. 1 建立了以下50µL pcr 反应:25 µL pcr 大师组合, 2.5 µL 底漆 F (10 µM), 2.5 µL 底漆 R (10 µM), 0.1 ng gRNA 表达载体 (pgRNA-pLKO. 1) 在 H2O。 孵育反应在 thermocycler 使用以下情况: 1 周期98° c 为三十年代, 32 个周期98° c 为十年代, 59 ° c 为十年代, 72 ° c 为三十年代, 1 个周期72° c 为 10 min。 根据制造商的说明, 用固相可逆固定化珠纯化 PCR 反应。洗在30µL 中的 H2O。 要强制连接器定向结扎到最终修复的, MNase 消化的 DNA 片段, 消化连接与适当的限制性酵素 (这里后 III 和 SacII)。设置以下反应: 为消化 5 ‘ 链接器与后 iii, 使用30µL 纯化 5 ‘ 链接增从步骤 5.3., 5 µL 的缓冲, 3 µL 的后 III (20 u/µL), 和12µL 的 H 2O。 为消化 3 ‘ 连接器与sacII, 使用30µL 纯化 3 ‘ 链接增从步骤 5.3., 5 µL 的缓冲, 3 µL 的sacii (20 U/µL), 和12µL 的 H2O。 孵育消化在37° c 为 3 h。 添加 DNA 凝胶加载染料和运行限制酶消化1% 琼脂糖凝胶。在 637 bp (5 “链接器摘要”) 和 295 bp (3 “链接器摘要”) 上对频带进行切除。 使用凝胶萃取试剂盒净化从切除的凝胶件的 DNA。 6. 连接器结扎和插入物的放大 建立一个14µL 结扎反应使用摩尔量的 MNase 消化, 最终修复片段和链接器序列。注意: 链接器到片段比率可以优化。建议包括无碎片控制 (NFC) 反应。 使用 5 ng MNase 消化的碎片 (最终修复和纯化), 120 ng 5 ‘ 链接器 (后 III 摘要, 纯化), 55 ng 3 ‘ 链接器 (SacII 文摘, 纯化), 1.4 µL T4 连接缓冲, 1.4 µL T4 在 H2O。 孵育的结扎反应在16° c 为16小时。不对酶进行热灭活。立即进行尼克翻译。注: 最终修复的 MNase 消化片段提供了 5 ‘ 磷酸盐必要的结扎连接, 因为连接器本身是不磷酸化。 对结扎反应 (和 NFC 反应) 增加以下:25 µL Taq 2X 大师组合 (能尼克翻译), 2.5 µL 底漆 Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2.5 µL 底漆 Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) 和6µLH2O。 包括无模板控件 (NTC)。在 thermocycler 上孵育反应使用以下条件: 1 周期 (尼克翻译):72 ° c 为 20 min, 1 周期:95 ° c 为5分钟, 3-4 个周期:95 ° c 为十五年代, 58 ° c 为十五年代, 72 ° c 为三十年代, 1 个周期:72 ° c 为 5 min。 采用固相可逆固定化珠进行反应清理, 样品珠比为1:1。洗在40µL 中的 H2O。 进一步放大所需的片段 (5 ‘ 链接器 + MNase 片段 + 3 ‘ 链接器) 使用适当的 PCR 试剂和以下引物: 使用12.5 µL PCR 大师组合, 1.25 µL 底漆 Linker-Minus450-F (10 µM, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1.25 µL 底漆 Linker-Plus275-R (10 µM, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 2.5 µL 的纯化尼克翻译产品从步骤6.4。7.5 µL 的 H2o 使用以下条件: 1 周期:98 ° c 为三十年代, 10-16 个周期:98 ° c 为十年代, °ç为十年代, 72 c 为十五年代, 1 周期:72 °为10分钟。注: 如有必要, 可同时设置多个反应, 以确保有足够的 PCR 产物用于后续步骤。为了在琼脂糖凝胶上可视化少量的 PCR 产物, 在步骤6.5 中设置额外的反应, 并将循环次数从15增加到32。这种反应可以作为质量控制, 如果增在15周期之后是不可见的。也包括无模板控件 (NTC)。 7. 尺寸选择 注意: 此步骤将 MNase 碎片与正确连接的 5 “和 3” 链接器从片段中分离出来, 其大小为两个 5 “或两个 3” 连接 “。 结合所有15周期 PCR 反应从步骤 6.5, 添加 DNA 加载染料和运行在0.8% 琼脂糖凝胶。使用一个凝胶萃取试剂盒对 869 bp 的突出频段进行切除并纯化 DNA。 量化的数量的 DNA (例如使用分光光度计)。 8. 通过吉布森组装将 PCR 扩增片段克隆成 gRNA 表达载体 准备组件主组合, 如下所示:注意: 以下步骤适用于吉布森et al.12。 通过结合3毫升的1米三 (羟甲基) 氨基 (三)-HCl pH 值 7.5, 创建6毫升等温反应缓冲器, 300 µL 1 米氯化镁, 60 µL 100 毫米脱氧三磷酸 (dGTP), 60 µL 100 毫米脱氧三磷酸 (dATP), 60 µL 100 毫米苷三磷酸 (dTTP), 60 µL 100 毫米脱氧三磷酸 (桩), 300 µL 1 M 糖 (德勤), 1.5 g 的聚乙二醇 (PEG)-8000, 300 µL 100 毫米烟酰胺腺嘌呤核苷酸 () 在超纯 H2O。注: 此缓冲器可 aliquoted, 贮存于-20 ° c。 结合320µL 的5X 等温反应缓冲器, 创建1.2 毫升的装配主组合, 3 µL 10 u/µL T5 酶, 20 µL 2 u/µL dna 聚合酶, 160 µL 的 40 u/µL dna 连接在超纯 H2o. 使用15µL 的组件主组合与5µL插入.注: 组件主混合可 aliquoted 并存储在-20 ° c, 在那里它是稳定的一年多, 可以容忍多个冻融循环。T5 酶的选择量是理想的使用长悬垂。 向量骨架消解注意: 在步骤8.3 中, 请确保将足够的矢量作为输入, 以满足所需的组件反应数量。 每反应, 增加以下: 1.5 µg gRNA 表达载体 (pgRNA-pLKO. 1), 5 µL 的缓冲, 1.5 µL 的年龄I (5 u/µL), 和38.5 µL h2o. 在37° c 下孵育文摘 2 h。 线性化向量的磷酸。注意: 这一步是建议的, 但不是绝对必要的。T5 酶在主组合将主要删除年龄我悬在之前的 Taq DNA 连接有机会采取行动。因此, 不需要对向量进行过多的再结扎。 加入2.5 µL 的虾碱性磷酸酶 (rSAP, 1 U/µL)。 孵育在37° c 为30分钟, 然后通过孵化在65° c 为5分钟钝化酶。 进行 DNA 纯化注意: 建议执行琼脂糖凝胶提取步骤。或者, 可以使用柱形或磁珠净化。重要的是要检查, 矢量消化是完整的, 如琼脂糖凝胶电泳。为了比较, 未消化的向量应该并行运行。 对样品中纯化的消化载体的数量进行量化。 用2倍的摩尔数来设置装配, 将刀片插入到向量中。每20µL 反应使用 100 ng 向量 (年龄I 消化从步骤 8.5), 12.2 ng 插入 (从步骤 7.1), 15 µL 的装配大师混合从步骤8.1.2。在 H2O 中。 孵育在50° c 为1小时。 用柱纯化净化反应。重的 DNA 在75µL 的 H2O (或适当的体积取决于电穿孔的规模)。注意: 转化效率很大程度上依赖于 DNA 纯度。其他纯化步骤 (如苯酚/氯仿萃取) 可能提高效率。 9. 电子 TG1 的制备大肠杆菌细胞 确保所有的离心机瓶和烧瓶在灭菌前漂洗和随后的蒸馏水中无洗涤剂。注意: 这一步有助于消除任何可能影响转化效率的杂质。水应在使用前立即丢弃。另外, 使用一次性离心瓶可能是可取的。 确保用于制备 electrocompetent 细胞的离心瓶、试管和溶液在使用前结冰。最好在寒冷的房间中进行以下步骤, 以尽量减少可能影响转换效率的温度波动。 准备2TY 介质。对16克 bacto 胰, 10 克酵母提取物, 和5克氯化钠, 加入蒸馏水到1升, 混合和高压釜。室温贮存介质。 准备2份琼脂涂层生物测定皿和 10 cm 培养皿, 含有适当的抗生素。贮存盘在4° c。注: 抗生素的选择取决于 gRNA 表达载体的性质, 使用100µg/毫升氨苄西林 pgRNA-pLKO. 1。 从甘油 TG1 细胞中刮出, 接种10毫升的2TY 培养基 (无抗生素)。 孵育文化在37° c 隔夜 (~ 16 h) 以震动在225转每分钟。 接种1升2TY 培养基 (不含抗生素) 与10毫升夜间培养 (1/100 稀释), 并平分它在两个2升烧瓶 (包含挡板)。 孵育文化在37° c, 225 转每分钟直到 OD600 毫微米0.55 被到达 (近似地在 1.5-2 h 以后)。使用分光光度计定期检查 OD600 nm。 冰镇文化冰上30分钟。 在四500毫升的离心机瓶 (冰前冷冻) 之间平分养殖。 离心机为15分钟在 4000 x g 在4° c 在一个预冷离心机。 醒酒清, 并添加1卷 (即250毫升) 前冷冷无菌蒸馏 H2O 到每一个离心机瓶。通过旋转或倒置瓶子 (如有必要, 通过轻柔的移) 重细菌颗粒。注: 通过先加入少量的水, 更容易重颗粒。确保颗粒最终完全悬浮。 离心机为15分钟在 4000 x g 在4° c。 重复洗涤两次 (步骤9.12 和 9.13)。除去上清液。迁当细菌颗粒在洗涤后变得越来越疏松时要小心。 重在50毫升的无菌, 冰冷的10% 甘油, 并转移到一个预冷50毫升离心管的颗粒。 离心机细胞15分钟在 ~ 4000 x g 在4° c。小心地除去上清液。 在2毫升的冰冷无菌10% 甘油中轻轻重细菌。 如果细胞被立即用于电穿孔, 请保持冰。注: 在0.5 毫升的干冰乙醇浴中, 细胞可在50µL 的等分中冷冻, 并贮存在-80 ° c, 但不推荐这样做。 10. TG1 Electrocompetent 的电穿孔大肠杆菌细胞 注: 电穿孔是综合图书馆产生的瓶颈之一。为了保持图书馆的代表性, 建议在必要的/切实可行的情况下进行许多个人电穿孔反应, 并执行下面描述的质量控制步骤 (10.6. 和 10.8)。 分的纯化反应 (从步骤 8.8) 到无菌和预冷 PCR 管, 并保持在冰 (1 µL 每管)。冷却 1 mm 间隙电穿孔试管在冰上。 添加25µL 的新鲜制备的 TG1 细胞直接到一个分的 DNA, 并立即转移到一个电穿孔试管的混合物。轻拍或轻击试管, 以确保细胞/DNA 混合物沿试管室的长度分布 (没有任何被困的空气或气泡)。 将试管放在滑动室中, 并启动适当的电穿孔程序 (例如, 1 脉冲1.8 伏 (EC1))。注: 时间常数应介于5.7 和6.0 毫秒之间. 万一 electroporator 弧线, 轻弹试管, 确保室内没有气泡, 再试一次。 立即添加975µL 室温2TY 介质到试管。 使用转移吸管, 移动 electroporated 细菌到50毫升管。重复步骤10.2。在一个50毫升的管子里收集所有与一个图书馆转换的细胞。 记录总卷。 质量控制步骤 为了量化新生成的电性细胞的能力, 使用定义数量的未切割质粒 DNA (如 10 pg pUC19 控制质粒) 进行单独的电击反应。把这个转到1.5 毫升的离心管注: 该能力应至少 1010菌落形成单位 (cfu) 每µg DNA。新鲜的细胞通常表现得比这更好。 孵育转化细菌在37° c 60 分钟晃动 225 rpm。 质量控制步骤: 在一个10厘米琼脂平板上, 用适当的抗生素选择, 将少量的细菌转化为库 (例如, 10 µL 10-100 倍稀释)。注意: 了解总的文化量 (从步骤 10.6), 得到的菌落数可以用来估计整个图书馆的菌落总数。20-30 图书馆的折叠表示法理想地应该被维护。 将细菌的其余部分分散到2TY 的琼脂涂层生物测定皿中, 其中含有适当的抗生素选择。注: 该培养液的体积可通过离心在 ~ 4000 x g 为10分钟 (或直到一个可见的颗粒形成, 上清看起来清晰) 减少。这减少时间板材需要烘干在传播以后文化。使用平板而非液态文化可以最大限度地减少个体群体的不成比例的增长。13 在一个额外的10厘米琼脂的 pUC19 控制电穿孔反应适当的体积, 适当的抗生素选择。 在37° c 的夜间孵育琼脂板 (16 小时)。 计数获得的控制板上的殖民地 (pUC19 和控制库板) 估计 CFU/µg DNA 的细菌以及图书馆的复杂性。 11. 质粒 DNA 的提取 将10毫升 2-TY 介质添加到隔夜板上, 用一次性的吊具将细菌层刮掉, 然后用50毫升的管子将其收集起来。重复几次, 直到所有的盘子看起来都是干净的。 使用质粒最大试剂盒提取 DNA (每个生物检测板需要2-3 列)。