대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

1입니다. Micrococcal Nuclease와 DNA의 소화 Micrococcal nuclease 효소 (MNase)의 각 새로운 배치에 대 한 반응을 최적화를 수행 합니다.참고: 사용 하는 MNase의 단위 수 시험 되어야 한다 (를 사용 하 여 직렬 희석, 그림 2A). 일반적으로, U의 MNase 소화 1 µ g의 5-10 정화 게놈 또는 BAC DNA 조건 5-100 bp의 범위까지 아래에 설명 된. 반응 당 1 µ L MNase 버퍼 x 10, 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 표적 DNA, MNase의 1 µ L의 1 µ g x 1의 설정 (0.1-50 단위) 10 µ L 반응 볼륨에서. 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 즉시 500 m m의 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N 1 µ L을 추가 하 여 효소를 비활성화 ‘, N’-tetraacetic 산 (EGTA). 2. DNA의 분리 조각 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 사용 하 여 샘플 버퍼/젤 염료 DNA 샘플을 로드를 추가 하 고 페이지 젤 20%에 로드. 크기 조정에 대 한 적절 한 DNA 사다리를 로드 (5 bp DNA 사다리). 젤 (1 µ g의 DNA 잘 당)를 오버 로드 하지 마십시오. 1.5 h의 주위에 또는 낮은 염료 앞 (bromophenol 파란색, 진한 파란색) 약 15 여행까지 혈압, 젤의 낮은 끝에 도달에 대 한 적절 한 1 x 트리 스-Borate-EDTA (TBE) 실행 버퍼 150 V (상수)에 젤을 실행 합니다. 젤 울트라 민감한 핵 산 얼룩을 사용 하 여 얼룩 하 고 자외선에서 시각화. 젤 이미지에서 크기에서 20-30 bp까지 소화 DNA에 대 한 MNase의 최적 농도 결정 합니다. MNase의 최적화 된 농도 사용 하 여 단계 1.2-2.2를 반복 하 여 대상 DNA를 소화. 일반적으로, 10-12 반응 (즉, 10-12 총 시작 물자의 µ g) 충분히 얻을 것 이다 설정 이후 단계를 진행 하려면 다음 페이지 젤 추출 DNA 소화. 살 균 메스를 사용 하 여 마커 레인 옆 젤 고 1 X는 매우 민감한 핵 산 얼룩의 신선한 1 x TBE 실행 버퍼와 사다리를 포함 하는 젤의 일부만 얼룩. DNA 사다리를 시각화 하 고 면도날을 사용 하 여 약 18-30 bp 사이 크기 범위에서 MNase 소화 DNA 파편을 삭제할.참고: 소화 MNase 조각 자외선에 노출 하지 마십시오. 그것은 (UV) 대신 청색 광원을 사용 하거나 자외선 아래 사다리의 이미지, 확장 하 고 MNase 소화 DNA 파편의 절단 가이드를 이것을 사용 하 여 인쇄 가능). 이 단계는 얼룩이 지 고 자외선에 DNA 파편의 노출 방지합니다. 오염을 방지 하는 사용 하지 않는, 살 균 일회용 메스 또는 면도칼 블레이드가이 단계에 대 한 항상 사용 합니다. Microcentrifuge 관 젤 슬라이스를 전송 합니다. 젤의 나머지 이상으로 핵 산 얼룩과 얼룩, 자외선에 노출 하 고 젤 절단 단계의 기록을 유지 하는 이미지를 기록 합니다. 3. 호감 담가 메서드를 사용 하 여 페이지 젤에서 DNA 파편의 격리 참고:이 단계에서 Sambrook 그 외 여러분 채택 되었습니다. 11 준비 페이지 젤 가용 화 버퍼 (1.88 mL 4 M 염화 아세테이트, 1 M 마그네슘 아세테이트의 150 µ L, 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (pH 8) 초순 H2O 15 mL의 전체 볼륨의 30 µ L). 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 마이크로 원심 튜브의 벽에 삭제 젤 슬라이스를 짝사랑. 추가 2 페이지 가용 화 버퍼의 볼륨 젤과 회전 하는 플랫폼에 16 h 37 ° C에서 품 어. microcentrifuge에서 최대 속도에서 1 분 샘플 원심 어떤 짓 눌린된 젤 조각 전송 하지 않도록 주의 복용 새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송. 0.5를 추가 볼륨 젤을 페이지 가용 화 버퍼의 작은, 소용돌이, 그리고 원심 분리 (3.4 단계)를 반복. supernatants 결합. 표준 페 놀-클로 프롬 적 출을 사용 하 여 DNA 파편을 압축을 풉니다.주의: 페 놀 오면 피부 접촉 또는 삼 킨 경우 독성이 있다. 장갑, 보호 안경, 연구실 코트 증기 두건에서 작업 등 안전 조치는 중요 합니다. 연구소의 규정에 따라 모든 페 놀 함유 폐기물의 처분. 샘플 및 소용돌이를 철저 하 게 한 양의 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (25:24:1)를 추가 합니다. 실 온에서 탁상 원심 분리기에 최대 속도 (16000 x g)에서 10 분 원심 분리기. 신중 하 게 신선한 microcentrifuge 튜브 위 수성 단계 전송. 알아서 하지 pipetting 동안 어떤 페 놀에이 월. 3.6.1 및 3.6.2 단계를 한 번 반복 합니다. 글 리 코겐, 3m 나트륨 아세테이트 (pH 5.2)의 0.1 볼륨의 소량 (0.2 µ L) 추가 및 100% 에탄올 (EtOH)의 2 권. 소용돌이 몇 시간 동안-20 ° C에서 품 어 나 밤새. 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 4 ° C에서 최대 속도로 30 분 동안 원심 분리기. 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 70%를 가진 DNA 펠 릿을 세척 EtOH. 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 4 ° C에서 최대 속도로 30 분 동안 원심 분리기. 상쾌한을 제거 하 고 DNA 펠 릿 건조. 모든 EtOH 증발 했다 다는 것을 확인 하지만-펠 릿 건조 하지 않도록 주의 하십시오. H2o.의 12 µ L 펠 릿 DNA를 분해참고: 페이지 젤 추출 매우 효율적입니다. 시작 하는 MNase로 소화 하는 DNA의 모든 10 µ g, 순화 된 파편의 1-20 ng 젤 추출 후 복구 기대 합니다. 1/6번째 로드 하 여 금액 및 파편의 무결성을 제어 (2 µ L) 페이지 젤 (그림 2C)에. 4. MNase 소화, 젤 정화 조각의 끝 수리 키트를 blunting DNA를 사용 하 여 다음 반응 설정: 10 µ L 단계 3.6.10, 버퍼, 1mm dNTP 믹스의 1.5 µ L, 효소 blunting의 0.6 µ L, H2o.의 1.4 µ L를 blunting X 10의 1.5 µ L에서에서 순화 된 DNA의 30 분 동안 22 ° C에서 품 어 그리고 열-비활성화는 효소 10 분 동안 70 ° C에 외피에 의해. H2O의 85 µ L을 추가 하 고는 반응 정리 표준 페 놀/클로 프롬-추출 및 EtOH-강수량 (섹션 3.6에서에서와 같이)를 사용 하 여 수행 합니다. 즉시 링커 결 찰을 진행 합니다. 5. 링커 생성 참고: 링커 섹션 3 링커 결 찰 즉시 진행 수와 동시에 증폭 될 필요가 있다. 아래 사용 뇌관 순서 선택한 gRNA 식 벡터에 대 한 적절 한 해야 합니다. 여기에 제시 된 그 벡터 pgRNA-pLKO.1에 대 한 설계 되었습니다. 9 pgRNA pLKO.1에서 5′ 링커의 확대를 위한 뇌관 순서 5′-링커-F (TTGGAATCACACGACCTGGA) 및 5′-링커-R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), 689 bp amplicon 저조한 사용 합니다. PgRNA-pLKO.1에서 3′ 링커의 증폭에 대 한 사용 하 여 뇌관 3′-링커-f: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) 3′-링커-r: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), 848 bp amplicon 따르. PCR 증폭 어댑터 (필요한 경우 선택 및 사용자 지정 뇌관 시퀀스의 시 약을 사용) gRNA 식에서에서 시퀀스. PgRNA-pLKO.1 다음 50 µ L PCR 반응 설정에 대 한: PCR 마스터 믹스의 25 µ L, 뇌관 F의 2.5 µ L (10 µ M), 뇌관 R의 2.5 µ L (10 µ M), 0.1 H2o.에에서 gRNA 식 벡터 (pgRNA-pLKO.1)의 ng 품 어 thermocycler 다음과 같은 조건에 반응: 1 주기 30 98 ° C s, 32 주기 98 ° C 10에 대 한 s, 59 ° C 10에 대 한 s, 72 ° C 30 s, 1 주기 72 ° C 10 분. 제조업체의 지침에 따라 단단한 단계의 가역 immobilization 비즈를 사용 하 여 PCR 반응 정화. H2o.의 30 µ L에 elute 최종 수리, MNase 소화 DNA 파편에 링커, (여기 뒷 다리III 및 SacII) 적절 한 제한 효소로 다이제스트 링커의 방향 결 찰을 시행 합니다. 다음 반응을 설정 합니다. 5′ 뒷 다리III와 링커의 소화, 사용 단계 5.3에서에서 순화 된 5′ 링커 amplicon의 30 µ L. 5, 버퍼, 뒷 다리(20U / µ L), III의 3 µ L 및 H2o.의 12 µ L의 µ L 3′ SacII와 링커의 소화, 사용 단계 5.3에서에서 정화 3′ 링커 amplicon의 30 µ L. 5, 버퍼, SacII의 3 µ L의 µ L (20 U / µ L), 및 12 µ L H2o. 3 h 37 ° C에서 다이제스트를 품 어. DNA 젤 로드 염료를 추가 하 고 1 %agarose 젤에 금지 효소 소화를 실행. 637에서 밴드를 삭제할 bp (5′ 링커 다이제스트) 및 295 bp (3′ 링커 다이제스트). 젤 추출 키트를 사용 하 여 삭제 젤 조각에서 DNA를 정화. 6. 링커 결 찰 및 삽입의 증폭 14 µ L 결 찰 반응 아데닌 양의 MNase 소화, 최종 수리 조각과 링커 시퀀스를 사용 하 여 설정 합니다.참고: 링커 조각 비율에 최적화 될 수 있습니다. 없는 조각 제어 (NFC) 반응을 포함 하는 것이 좋습니다. MNase 소화 조각 (최종 수리 하 고 정화), 120의 사용 5 ng ng 5′ 링커 (뒷 다리III 다이제스트, 정화)의 55 ng 3′ 링커 (SacII 다이제스트, 정화), T4 리가 버퍼의 1.4 µ L 및 H2o. 집중된 T4 DNA 리가의 1.4 µ L의 결 찰 반응 16 h 16 ° C에서 품 어. 할 하지 열 비활성화는 효소. 즉시 닉 번역을 진행 합니다.참고: 최종 수리 MNase 소화 조각 제공 5′ 인산 염 필요한 링커의 결 찰, 링커로 스스로 하지 않습니다 취소 osphorylated. 결 찰 반응 (와 NFC 반응) 추가 다음: 마스터 믹스 (닉 번역 가능) X Taq 2의 25 µ L, 뇌관 링커-Minus450-F의 2.5 µ L (10 µ M, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 뇌관 링커-Plus275-R의 2.5 µ L (10 µ M, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC)와 6 µ L의 H2o. No-템플릿 컨트롤 (NTC)를 포함 합니다. Thermocycler 다음과 같은 조건에 반응을 품 어: 1 주기 (닉 번역): 20 분, 1 개 주기를 위한 72 ° C: 95 ° C 5 분, 3-4 사이클에 대 한: 95 ° C 15에 대 한 s, 58 ° C 15에 대 한 s, 72 ° C 30 s, 1 주기: 5 분 동안 72 ° C. 반응 정리 단단한 단계의 가역 immobilization 구슬 구슬 비율 1: 1의 샘플 사용 하 여 수행 합니다. H2o.의 40 µ L에 elute 원하는 조각 증폭 (5′ 링커 + MNase + 3 조각 ‘ 링커) 적절 한 PCR 시 약 및 다음 프라이 머를 사용 하 여: PCR 마스터 믹스의 12.5 µ L, 뇌관 링커-Minus450-F의 1.25 µ L를 사용 하 여 (10 µ M, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 뇌관 링커-Plus275-R의 1.25 µ L (10 µ M, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 단계 6.4에서에서 순화 된 닉 번역 제품의 2.5 µ L. 7.5 µ L H2o.의 사용 다음 조건: 1 주기: 98 ° C 30에 대 한 s, 10-16 주기: 98 ° C 10 s, 63 ° C 10 s, 15 72 ° C s, 1 주기: 10 분 동안 72 ° C.참고: 필요한 경우, 여러 가지 반응은 설정할 수 있습니다 병렬로 후속 단계에 대 한 충분 한 PCR 제품 확인 하. Agarose 젤에 PCR 제품의 소량을 시각화 하려면 단계 6.5에서 추가 반응 고 32 15에서 주기 수를 증가 합니다. 이 반응은 amplicons 15 주기 후 표시 되지 않는 경우 품질 관리로 사용할 수 있습니다. 또한 아무 템플릿 컨트롤 (NTC)를 포함 합니다. 7. 크기 선택 참고:이 단계 두 조각에서 제대로 연결 된 5’과 3′ 링커 MNase 조각 분리 5′ 또는 3’ 링커 두 크기에 따라. 모든 15 주기 PCR 반응 단계 6.5에서에서 결합., 염료를 로드 하는 DNA를 추가 하 고 0.8 %agarose 젤에서 실행. 869에서 눈에 띄는 밴드 삭제할 혈압 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. (예: 한 분 광 광도 계를 사용 하 여) DNA의 양을 계량. 8. 복제 식 벡터 깁슨 어셈블리에서 gRNA에 PCR 증폭 조각의 어셈블리를 준비 같이 믹스 마스터:참고: 다음 단계는 깁슨 외. 에서 적응 12. 1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)의 3 mL을 결합 하 여 6 mL 등온 반응 버퍼를 만들-HCl pH 7.5, 1 M MgCl, 100 mM deoxyguanosine 3 인산 염 (dGTP)의 60 µ L, 100 mM deoxyadenosine 3 인산 염 (dATP)의 60 µ L, 100 mM deoxythymidine의 60 µ L의 300 µ L 3 인산 염 (dTTP), 100 mM deoxycytidine 3 인산 염 (dCTP), 1 M dithiothreitol (DTT), 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)-8000, 100 mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) 초순 H2o.의 300 µ L의 1.5 g의 300 µ L의 60 µ L참고:이 버퍼 aliquoted 및-20 ° c.에 저장 될 수 있습니다. 등온 반응 버퍼 X 5의 320 µ L, 3 µ L 10 U / µ L T5 exonuclease, 2 U / µ L DNA 중 합 효소, 초순 H2o. 사용 15 µ L 어셈블리 마스터 믹스의 5 µ L로에서 40 U / µ L DNA 리가의 160 µ L의 20 µ L의 결합 하 여 1.2 mL 어셈블리 마스터 믹스 만들기 삽입 합니다.참고: 어셈블리 마스터 믹스 어디 그것은 1 년 이상에 대 한 안정적인 aliquoted 및-20 ° C에서 저장 될 수 있으며 여러 freeze-thaw 주기를 용납 수 있습니다. T5 exonuclease의 선택한 금액 긴 오버행 사용 하기 위해 이상적입니다. 벡터 백본 소화참고: 어셈블리 반응 단계 8.3에서에서 원하는 수에 대 한 입력으로 충분 한 양의 벡터를 소화 해야 합니다. 반응, 당에 다음을 추가: gRNA 식 벡터 (pgRNA-pLKO.1), 버퍼의 5 µ L, 나이의 1.5 µ L의 1.5 µ g 2 h 37 ° C에서 소화 하는 나 (5U / µ L), 및 H2o. 품 38.5 µ L. 선형화 벡터의 dephosphorylation입니다.참고:이 단계는 권고, 하지만 엄격 하 게 필요 하지 않습니다. T5 exonuclease 마스터 믹스에 주로 나이제거할 것 이다 내가 overhangs Taq DNA 리가 행동 전에. 따라서, 벡터의 과도 한 다시 결 찰은 예상 되지 않음. 새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소 효소 (rSAP, 1 U / µ L)의 2.5 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 하 고 5 분 동안 65 ° C에서 배양 하 여 효소 비활성화. DNA 정제를 수행참고: 그것은 agarose 젤 추출 단계를 수행 하 고 좋습니다. 또는, 열-또는 정화를 사용할 수 있습니다. 그것은 벡터 소화 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 예를 들어 완전 한지 확인 해야 합니다. 비교를 위해, 소화 되지 않은 벡터를 병렬로 실행 해야 합니다. 샘플에서 순화 된 소화 벡터의 양을 계량. 벡터에 삽입의 2-fold 어 금 니 과잉을 가진 어셈블리를 설정 합니다. 20 µ L 반응 사용 100 ng 벡터 (연령단계 8.5에서에서 소화)의 당 12.2의 ng (에서 단계 7.1.), 15 µ L 단계 8.1.2에서에서 어셈블리 마스터 믹스의 삽입. H2o. 1 시간에 50 ° C에서 품 어. 정화 열 정화를 사용 하 여 반응. H2O의 75 µ L에서 DNA를 resuspend (또는 볼륨 electroporation의 규모에 따라 적절 한).참고: 변환 효율은 DNA 순도에 크게 의존. 추가 정화 단계 (예: 페 놀/클로 프롬 적 출) 효율성을 향상 시킬 수 있습니다. 9. 전기 유능한 TG1 대장균 세포의 준비 모든 원심 병 플라스 크에서에서 자유롭다 세제 헹 구 고 압력가 마로 소독 하기 전에 증류수와 후속 작성 하 여 확인 합니다.참고:이 단계는 변환 효율에 영향을 미칠 수 있는 모든 불순물을 제거에 도움이 됩니다. 물 사용 하기 전에 즉시 폐기 해야한다. 또는, 일회용 원심 병의 사용은 권장 수 있습니다. 원심 분리기 병, 튜브 및 electrocompetent 세포의 준비를 위해 사용 되는 솔루션 사용 하기 전에 얼음에 차게 됩니다 확인 하십시오. 이 변환 효율에 영향을 미칠 수 있는 온도 동요를 최소화 하기 위해 차가운 방에 다음 단계를 수행 하는 좋습니다. 2TY 매체를 준비 합니다. Bacto tryptone의 16 g, 효 모 추출 물의 10 g 및 5 g의 NaCl, 1 L, 믹스, 압력솥을 증류수를 추가합니다. 실 온에서 저장소 매체입니다. 2TY agar 코팅 생물 요리와 적절 한 항생제를 포함 하는 10 cm 배양 접시를 준비 합니다. 4 ° c.에 접시를 저장참고: 항생제의 선택 gRNA 표정 벡터, pgRNA-pLKO.1에 대 한 사용 100 µ g/mL 암 피 실린의 성격에 따라 달라 집니다. (항생제) 없이 2TY 매체의 10 mL를 접종 하 TG1 셀의 글리세롤 재고에서 다쳤어요. 225 rpm에서 떨고 37 ° C에서 하룻밤 (~ 16 h) 문화를 품 어. 야간 문화 (1/100 희석) 10 mL와 함께 (항생제) 없이 2TY 매체의 1 L를 접종 하 고 2 개의 2 L 플라스 크 (배플을 포함 하는) 사이 동등 하 게 분할. 37 ° C, 0.55의 OD600 nm (약 1.5-2 시간) 후에 도달할 때까지 225 rpm에서 문화를 품 어. 분 광 광도 계를 사용 하 여 OD600 nm을 정기적으로 확인. 30 분 동안 얼음에 진정 문화입니다. (미리 얼음에 냉장) 4 개의 500 mL 원심 병 사이 동등 하 게 문화를 분할. 미리 냉장된 원심 분리기에서 4 ° C에서 4000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기. Supernatants 가만히 따르다와 원심 병의 각 미리 냉장된 차가운 멸 균 증류수 H2O의 1 볼륨 (예: 250 mL)을 추가 합니다. Resuspend 세균 펠 릿 소용돌이 또는 병을 반전 하 여 (또는 부드러운 pipetting, 필요한 경우).참고: 그것은 먼저 물 한 작은 볼륨을 추가 하 여 펠 릿 resuspend 쉽습니다. 펠 릿은 결국 resuspended 완전히 확인 합니다. 4 ° c.에 4000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기 반복 세척 두 번 (단계 9.12. 9.13 및). 제거는 상쾌한. 세척 후 세균 펠 릿 점점 느슨한 되면서 decanting 때 주의 해야 합니다. 살 균, 얼음 10% 글리세롤의 50 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 사전 냉장된 50 mL 원심 분리기 튜브에 전송. 4 ° c.에 ~ 4000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기 셀 조심 스럽게 제거는 상쾌한. 부드럽게 차가운 살 균 10% 글리세롤의 2 mL에 박테리아 resuspend. 셀 electroporation 즉시 사용 하는 경우에 얼음에 계속.참고: 셀 드라이 아이스 에탄올 욕조에 0.5 mL 튜브에 50 µ L의 aliquots에서 냉동 고 수-80 ° C에 저장 하지만이 권장 하지 않습니다. 10. Electroporation TG1 Electrocompetent 대장균 세포의 참고: Electroporation 포괄적인 라이브러리 생성에는 병목 현상을 중 하나입니다. 도서관 대표를 유지 하려면 것이 좋습니다 필요한/주문 많은 개별 electroporation 반응을 실시 하 고 아래 설명 하는 품질 관리 단계를 수행 (10.6. 그리고 10.8.). Aliquot 살 균과 미리 냉장 PCR에 (단계 8.8)에서 정화 반응 튜브 얼음 (관 당 1 µ L)에 그들을 유지. 얼음에 1 mm 간격 electroporation 큐 벳을 진정. DNA의 한 약 수에 직접 갓된 TG1 셀의 25 µ L을 추가 하 고 즉시 electroporation 베트로 혼합물을 전송. 영화 또는 탭 셀/DNA 조합을 보장 하기 위해 베트 (없이 어떤 덫을 놓은 공기 또는 거품) 베트 챔버의 길이 따라 배포 됩니다. 슬라이드 챔버에는 베트 하 고 적절 한 electroporation 프로그램을 시작 (예: 1 펄스 1.8의 kV (EC1)).참고: 시간 상수 속여야 한다 5.7 6.0 양 사이의 경우 electroporator 호 영화는 베트, 챔버에 있는 아무 공기 거품을 확인 하 고 다시 시도 하십시오. 즉시는 베트를 실내 온도 2TY 매체의 975 µ L를 추가 합니다. 전송 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 튜브에 electroporated 박테리아를 이동 합니다. 10.2 단계에서를 반복 합니다. 그리고 한 50 mL 튜브에 하나의 라이브러리 변환 하는 모든 셀을 수집 합니다. 전체 볼륨을 문서화 합니다. 품질 관리 단계 갓 생성 된 전기 유능한 세포의 능력을 계량 하려면 정의 된 양의 포경된 플라스 미드 DNA (예: 10 세 pUC19 제어 플라스 미드)를 사용 하 여 별도 electroporation 반응을 수행 합니다. 1.5 mL microfuge 관에이 전송 합니다.참고: 역량 1010 콜로 니 형성 단위 (cfu) µ g DNA 당 이어야 한다. 갓된 셀 일반적으로 이것 보다 더 나은 수행합니다. 225 rpm에서 떨고 60 분 동안 37 ° C에서 변형 된 박테리아를 품 어. 품질 관리 단계: 플레이트 정의 된 적은 양의 적절 한 항생제 선택 10 cm 한 천 배지에서 라이브러리 (예: 10 10-100 배 희석의 µ L)으로 변형 하는 박테리아.참고: (에서 단계 10.6.) 총 문화 볼륨을 알면, 얻은 식민지 수 추정 전체 라이브러리에 대 한 식민지의 총 수를 사용할 수 있습니다. 라이브러리의 20-30 배 표현은 이상적으로 유지 되어야 합니다. 분산 2TY agar 코팅 검정 요리 적절 한 항생제 선택에 박테리아의 나머지.참고: 문화의 볼륨 ~ 4000 x g 10 분 (또는 보이는 펠 릿을 형성 하 고는 상쾌한 명확한 표시)에서 원심 분리 하 여 줄일 수 있습니다. 이 접시는 문화의 확산 후 건조 하는 시간을 줄일 수 있습니다. 사용 액체 문화 보다는 오히려 번호판의 개별 식민지의 불균형 성장을 최소화 한다. 13 적절 한 항생제 선택과 추가 10 cm 한 접시에 pUC19 제어 electroporation 반응의 적절 한 볼륨을 확산. 한 천 배지 하룻밤 (16h) 37 ° c.에 품 어 라이브러리 복잡성 뿐만 아니라 CFU / µ g DNA는 박테리아에 대 한 추정을 컨트롤 플레이트 (pUC19 및 컨트롤 라이브러리 격판덮개)에 얻은 식민지를 계산 합니다. 11입니다. 플라스 미드 DNA의 추출 밤새 번호판 2-타이 미디어의 10 mL를 추가 하 고 일회용 분산기를 사용 하 여 접시에서 세균 층을 긁어 50 mL 튜브에 수집. 모든 접시의 깨끗 한 때까지 몇 번을 반복 합니다. (2-3 열 필요한 바이오 분석 결과 당 접시) 플라스 미드 맥시 키트를 사용 하 여 DNA를 추출 합니다.