Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Martina Loibner; Lisa Oberauner-Wappis; Christian Viertler; Daniel Groelz; Kurt Zatloukal

doi:10.3791/55885

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

Протокол для HER2 рыбы с использованием не кросс ссылок, бесплатно формалин ткань фиксатором объединить преимущества крио сохранение и формалином фиксации

Published: December 25, 2017

doi:

10.3791/55885

Martina Loibner^1,2, Lisa Oberauner-Wappis^1,2, Christian Viertler², Daniel Groelz³, Kurt Zatloukal^1,2

¹Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology,Medical University Graz, ²Institute of Pathology,Medical University Graz, ³Research and Development,Qiagen GmbH

Summary

В сочетании с гистопатология и молекулярной диагностики для отбора терапии в персонализированной медицины часто требуется флуоресцентной гибридизации in situ (рыба). Роман не кросс ссылок, бесплатно формалин ткань фиксатором, который позволяет высокого качества морфологической, молекулярной и рыбы анализов от же образца путем добавления после фиксации шаг перед рыба представлено.

Abstract

Морфологическая оценка образцов, формалин исправлена, парафин врезанных тканей (FFPE) был золотым стандартом для диагностики рака на протяжении десятилетий из-за его отличное сохранение морфологии. Персонализированной медицины чаще предоставляет индивидуально адаптированы и целевой терапии характеризуется отдельных заболеваний, активизируемые комбинированных молекулярных и морфологических аналитических технологий и диагностики. Производительность молекулярных и морфологических анализов из же образца FFPE сложной из-за негативного воздействия формалином из-за химической модификации и структурообразования нуклеиновых кислот и белков. Не кросс ссылок, бесплатно формалин ткань фиксатором недавно была разработана выполнять оба требования, то есть, чтобы сохранить морфология как FFPE и биомолекул как крио сохранение. Так как рыба часто требуется в сочетании с гистопатология и молекулярной диагностики, мы протестировали применимость рыбы протоколов на ткани, относились с этой новой фиксатором. Мы нашли что формалин после фиксации Гистологические срезы не кросс-ссылок, формалин свободных и парафин врезанных (NCFPE) молочной железы рак ткани создаются эквивалентные результаты для тех, кто с FFPE ткани в рецептор человека эпидермального фактора роста 2 (HER2) Анализ рыбы. Этот протокол описывает, как рыбы пробирного первоначально разработан и апробирован для ткани FFPE может использоваться для NCFPE тканей простой шаг после фиксации Гистологические срезы.

Introduction

Персонализированной медицины во все большей степени полагается на испытания Многопараметрический анализ молекулярных и морфологических ткани. Формалин фиксации тканей как золотой стандарт обеспечивает отличные качества морфологической¹^,². Однако формалин индуцированной химическая модификация и cross-linking белков и нуклеиновых кислот³^,^,⁴⁵ отрицательно вмешивается молекулярный анализ⁶. Эти молекулярные изменения ограничивают качество нуклеиновых кислот и белков и может привести к генной последовательности артефакты⁷ или пониженную чувствительность полимеразной цепной реакции (ПЦР)-на основе анализов⁸. Хотя основные усилия были приняты для оптимизации молекулярные тесты для FFPE ткани, крио сохранение тканей находится в общих превосходит формалин фиксации, что делает необходимым разделить образцы тканей для сохранения различных процедур. Чтобы избежать необходимости крио сохранения для молекулярного анализа, не кросс ссылок, фиксирующие формалин бесплатно, PAXgene ткани был разработан. Это коммерчески доступных система состоит из фиксации и стабилизации раствор, содержащий различные спирты, уксусная кислота и растворимых органических соединений. Надлежащее сохранение нуклеиновых кислот, белков (phospo) и морфология был показан в нескольких исследованиях⁶^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³.

Одного конкретного приложения в диагностике рака является рыба, обнаруживать широкий спектр хромосомные изменения, например транслокации, субмикроскопических удалений и амплификаций ¹⁴. Например, 20% опухолей инвазивным молочной железы рак Показать амплификации рецептора человека эпидермального фактора роста 2 (HER2) ген¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, который связан с плохой прогноз¹⁸ ^,¹⁹. Определение статуса HER2 гиперэкспрессия и усиления рака молочной железы рыб необходимо выбрать пациентов для анти HER2-направленных терапии и является спутником диагностических перечисленных федеральных наркотиков ассоциации (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)¹⁷. Для того, чтобы разрешить широкое применение диагностики на основе рыбы компаньон в сфере здравоохранения, анализов были разработаны и утверждены для FFPE тканей.

В предыдущем исследовании мы показали, что NCFPE тканей не может использоваться для рыбы анализов, которые были утверждены для FFPE ткани. Однако испытания времени, серия процедур фиксации различных пост NCFPE тканей с буферизацией 4% формальдегида, показали, что после фиксации раз в 18 ч или более разделов ткани NCFPE эквивалентные результаты для тех, кто с FFPE тканей¹⁴.

В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол и продемонстрировать, что влияние не кросс ссылок, бесплатно формалин ткань фиксации и 24 h 4% буфер после фиксации формальдегида на секции для HER2 рыбы и РНК качества от же образца основной ткани.

Рис 1: диаграмма, показывающая шаги для флуоресценции в situ гибридизация (рыба) и РНК анализа формалин фиксированной парафин встроенных (FFPE) и не кросс ссылок, формалин бесплатно фиксированной парафин врезанных тканей (NCFPE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

Исследования был одобрен Комитетом по этике медицинского университета в Граце (ссылка номер 20-066), Австрия. Образцы тканей были получены из двух случаев хирургической резекции первичной инвазивным молочной железы после пациентов дано письменного информированного согласия. 1. ткань фиксации Примечание: Ткани, фиксация выполняется либо с стандартным буферизации формалин решение (SBFS), определяется как формалина 10% раствор, содержащий Массовая доля формальдегида 3,7% (соответствующий объёмная 4%), буфер рН 6,8 до pH 7.2 согласно CEN/TS 16827-1:2015 или не кросс ссылок, бесплатно формалин ткань система фиксации (также именуемых ниже решения альтернативной фиксации) состоящий из фиксатором и стабилизатор раствора при комнатной температуре (RT). Разрежьте груди Рак образцы тканей с стерильным скальпель на две половинки каждого 4 мм для обеспечения адекватного ткани количество. Используйте максимальный размер 4 x 15 x 15 мм для фиксации NCFPE или SBFS ткани. Место каждой половине образца тумора в кассету стандарта ткани и погрузите его в SBFS или альтернативных фиксации решение для 24 ч с объемом соотношение (v/v) тома 4 частей фиксатором и одна часть ткани (ткани идеально 10 мл/1 g 4 мл/1 g). Передача образцов альтернативно исправлена в стабилизатор решение для 2-72 h, открыв контейнер, поворачивая ткани кассеты на 180° и погрузив его. Место ткани кассеты с образцами SBFS-исправлена в 250 мл 70% этанол 30 мин на RT для удаления остатков SBFS.Примечание: Этот шаг имеет важное значение избежать загрязнения SBFS не кросс ссылок фиксатором лечение образцов в автоматизированных тканей процессор, который будет уничтожить полезные свойства non кросс ссылок фиксаторы для сохранения биомолекул.Предупреждение: SBFS представляет собой опасные решение, вызывает раздражение кожи, повреждения серьезные глаз, может вызвать аллергическую реакцию на коже, предположительно вызывает генетические дефекты, может вызвать рак, раздражение дыхательных путей, сонливость и причины повреждения органов. Альтернативные фиксатором токсичных при вдыхании, при контакте с кожей и при глотании, раздражает глаза и кожу, опасность очень серьезного необратимого воздействия через при вдыхании, при контакте с кожей и при глотании. Для обоих решений фиксации следует избегать вдыхания и физический контакт. Носите подходящую защитную одежду, перчатки и защита глаз и лица. Работа в зонта. Приступить к обработке тканей, внедрение и ткани секционирование (разделы 2 и 3). 2. ткани обработки и встраивание Выполнение поэтапного обезвоживания тканей кассет с образцами фиксированных тканей в 70% (2 x 15 мин.), 80% (30 мин), 90% (60 мин), и 99% (2 x 60 мин) этанола, следуют ксилола (2 x 60 мин). Затем проникнуть с парафином в процессоре автоматизированной ткани (4 х 45 мин). С помощью щипцов, место обезвоженной и проникли в парафин образцы (в качестве альтернативы и SBFS-исправлена) в металлических формах. Внедрить образцы в расплавленный парафин 5-10 мл (точки затвердевания 56-58 ° C) с использованием парафина встраивание документа. Место формы на охлаждения пластину на-5 ° C в течение 30 мин. Восстановление блоков парафин врезанных тканей из формы. Хранить результирующие блоки (альтернативно исправлена, парафин врезанных (NCFPE) и SBFS-Исправлена парафин врезанных (FFPE)) в темноте при температуре 4 ° C до использования. 3. ткань секционирование и слайд подготовка для рыбы Примечание: FFPE разделы непосредственно используются для рыбы, в то время как слайды с NCFPE секции крепятся пост в SBFS за 24 ч до процедуры рыбы. Вставьте лезвием одноразового использования в микротома и отрегулировать микротом до 10 мкм. Возьмите первый блок от охлаждения пластины и вставить его в документ. Отделка блок до достижения ровной поверхности. Чистить щеткой микротома и настроить его до 3 мкм. отменить первые 2-3 секции. Вырежьте 3 мкм секции NCFPE и FFPE блоков и поместите их в ванну с холодной водой (ультрачистая вода).Примечание: Чтобы получить лучше фотографии без перекрывающихся ядер, здесь, изображения 2 мкм секций вместо 3-5 мкм, как это рекомендовано в manufacturer´s инструкции отображаются. Подберите каждый плавающей секции с тонкой кистью и иглы на покрытые микроскопа для адгезии разделах ткани. Ввергнуть этот слайд в теплой (40 ° C) воды ванна и пусть секции растянуть полностью. Вернуть секции на слайд, осторожно потянув слайд из воды и избежать морщин. Пусть все секции сухой на при комнатной температуре в течение 1 ч. Тепло слайды при 70 ° C на 30 мин в инкубаторе для плавления парафина. Поместите слайды по горизонтали в стакане, окрашивание банку. Регидратационный разделов, поэтапно на RT в окрашивание банки заполнены с 250 мл следующих жидкостей: 100% ксилола 2 x 15 мин, этанол 96% 2 x 15 мин., 90% этанола 2 мин, 80% этанола 2 мин., 70% этиловом спирте 2 мин, 50% этиловом спирте 2 мин и дистиллированной воде 2 раза по 10 мин.Предупреждение: Выполните депарафинизации и регидратации в вытяжного шкафа, не вдыхать токсичные летучем растворителей.Примечание: В зависимости от участков и ткани, это может быть необходимо протестировать различные инкубации раз заранее. 4. После фиксации образцов NCFPE Выполните после фиксации NCFPE слайды, поместив их в новое окрашивание банку заполнены с SBFS 24 h на RT. месте банку в Зонта на этапе после фиксации 24 h. Удалить излишки SBFS промывкой фосфат буфер солевой раствор (3 x 10 мин) и дистиллированной воде (2 x 10 мин). 5. флуоресценции в situ гибридизация (рыба) Примечание: Здесь рыба выполняется с использованием коммерчески доступных зонд HER2/CEN17 двухцветный комплект согласно инструкциям производителя. Не позволяют разделов ткани высохнуть при гибридизации и мытье шаги. Не позволяйте ДНК-зонд и 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ДНК изображение решения подвергаться воздействию света на более длительный период. Выполните эти шаги в темноте с помощью светонепроницаемыми контейнеров. В зависимости от возраста и фиксации шаг выборки материала увеличить или уменьшить денатурации и мыть температур для получения лучших результатов гибридизации. Место окрашивание jar, содержащий 250 мл раствора лимонной в водяной бане 98 ° C предварительной обработки тепла. Регидратированные FFPE и после фиксированного NCFPE слайды в банку и Инкубируйте 15 мин.Не используйте более чем шести слайдов на окрашивание банку. Вымойте слайды в дистиллированной воде в течение 3 мин на RT в новое окрашивание банку. Для протеолиза место слайды в систему гибридизации температуры при 37 ° C. Сразу же, применяются решения готовые к использованию пепсин (2 мг/мл) каплям (~ 30 мкл на каплю) для разделов ткани до тех пор, пока она полностью покрыта. Инкубируйте 9 минут при 37 ° C в системе гибридизации.Примечание: Рекомендуется время инкубации 5-15 мин. Оптимальное время для протеолиза должны определяться заранее. Поместить слайды в сосуд, содержащий мыть буфера SSC и инкубировать в течение 5 мин. Промойте слайды в дистиллированной воде в течение 1 мин на RT. Выполняют обезвоживания секций в следующих градуированных спирты: 50%, 70%, 90% и 100% за 1 мин воздух сухой разделы. Для гибридизации, пипетки 10 мкл HER2/CEN17 зонда на разделах сухой ткани, охватывают каждого образца с coverslip и запечатать его с резиновый клей.Примечание: рекомендуется 10 мкл зонд на площади ткани 22 x 22 мм. Нежной потепления зонда упрощает процесс дозирования. Избегайте пузыри и длительного воздействия на свет зонда. Совместное Денатурируйте зонд и образец ДНК в системе гибридизации в 75 ° C в течение 10 мин. Установите систему гибридизации до 37 ° C и гибридизировать на ночь. Осторожно удалите резиновый клей с щипцами для обнаружения и после гибридизации. Инкубируйте слайды в окрашивание сосуд содержащий 37 ° C в предварительно разогретой 1 x мыть буфер A для 5 минут удалить coverslips. Вымойте слайды с помощью предварительно нагревают 1 x мыть буфера A дважды за 5 минут при 37 ° C. Обезвоживает слайды в 70%, 90% и 100% этанола, 1 мин. Сухие образцы в воздухе и защищать от света. Для окрашивания, применять 30 мкл DAPI-решение гибридизированные район, избегая пузыри. Охватывают разделы с coverslip. Инкубируйте 15 мин, защищенном от света. Осторожно удалите избыток DAPI-решение, осторожно нажав слайд между фильтр документов. Храните слайды при температуре 2-8 ° C в темноте на срок до 2 недель до оценки confocal микроскопии. 6. конфокальная томография и сканирование слайдов рыбы Конфокальный изображений и сканирование слайдов на конфокальный цифровой сканер оснащен 40 x / 1.2 Цель NA, диапазонные фильтры (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) и 5.5Mpx, 16 бит, охлаждением научных комплементарный металло-оксидный полупроводник (CMOS) камеры. Получать изображения с фильтрами для зеленого (возбуждения: 503 Нм, выбросов: 528 Нм) и оранжевый (возбуждения: 547 Нм, выбросов: 572 Нм) каналы. 7. толкование Примечание: Зонд HER2/CEN17 представляет собой смесь красного флюрохром, меченного CEN17 зонд конкретных для альфа-Спутниковое прицентромерного региона хромосомы 17 (D17Z1) и зеленый флюрохром, меченного HER2 зонд конкретных HER2 гена (зонд расположение 17q12). Образцы опухоли с HER2:CEN17 соотношение ≤2.0 в ядро забил как нормальный, тогда как те, с ≥2.0 отношение HER2:CEN17 забил как усиленный17. Анализ качества изображения с открытым исходным кодом CaseViewer 2.120. Оцените по крайней мере 20 клеток, которые расположены в двух различных регионах компонента инвазивной карциномы, как определено патологоанатом. Включите ясно distinguishable хорошо распределенных ядер в области подсчета. Исключите из подсчета регионов ткани на границе и отозванные или запивая областях. 8. РНК качество Извлечение RNA Убедитесь, что все инструменты и средства являются РНКазы бесплатно. Используйте решение, RNAse удаление. Вырежьте 10 до 20 разделов (толщиной 5 мкм) NCFPE или FFPE образцов, используя микротом после протокола до шаг 3,8. Извлечь РНК из NCFPE образцов с помощью РНК изоляции комплект (см. таблицу материалы). Извлечь РНК из образцов FFPE с помощью набора для изоляции FFPE РНК.Примечание: Добыча РНК из не кросс ссылок фиксативов требует метод изоляции, адаптированных к методу фиксации. Не используйте любой другой РНК изоляции метод (например, Тризол, RNeasy FFPE, и т.д. для NCFPE образца). Определение концентрации РНК и чистоты, используя спектрофотометр. Коэффициент поглощения на 260 Нм и 280 Нм (A260/280) должно быть ~ 2.0. Храните отдельные РНК-70 ° c до дальнейшего анализа. Выполните 3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) Глицеральдегид в режиме реального времени обратной транскрипции ПЦР с праймерами для создания ампликонов разной длины8,9. Использование обратной транскрипции Кит cDNA согласно manufacturer´s инструкции для синтеза cDNA. Используйте 500 нг РНК каждого образца. Хранение cDNA при-20 ° C до дальнейшего использования. Подготовка мастер смесь ПЦР согласно manufacturer´s инструкции. Пипетка мастер смесь ПЦР в triplicates в пластине 384-ну реакции. Добавить 4 мкл рабочего раствора 1:16 разбавленной cDNA (ПЦР шаблон). Выполняйте ПЦР согласно manufacturer´s инструкции.Примечание: Для человеческого GAPDH, были использованы следующие грунты: GAPDH вперед: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH Реверс: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ и 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´. Анализировать результаты с помощью программного обеспечения применимы к ПЦР машины. Неспецифические продукты должны быть исключены основе плавления кривой анализ21.

Representative Results

Определение HER2 рыбы: Интенсивность сигнала HER2-рыбы от FFPE и NCFPE являются аналогичными (рис. 2). Обоих случаях в большинстве клеток показывают ясно избыток зеленого сигнала (ориентировочный усиливается Локус гена HER2) по сравнению с красный сигнал (CEN17 ссылка гена). Таким образом этот случай показывает усиленный HER2 гена, что означает, что, как ожидается, этот пациент реагировать трастузумаб, анти HER2 целевой терапии. Образец FFPE служил в качестве позитивного управления. Сигналы, наблюдается в не неопластических клеток (как в FFPE и NCFPE) служат внутренние ссылки и отрицательный контроль для амплификации гена HER2. Для каждого анализа серии по крайней мере один раздел с известными амплификации генов статус должен использоваться в качестве позитивного управления для гибридизации реакции. РНК качество: Соответствующие FFPE и NCFPE пробы из двух разных случаев показывают различия в качестве РНК путем использования в реальном времени обратной транскрипции ПЦР. Полученные результаты показывают различные усилители эффективности для различных ампликон длин (т.е., 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) GAPDH мРНК. Все КТ (цикл порог) значения, полученные из FFPE образцы были выше, чем от NCFPE. Это различие показано нижней ПЦР amplificability мРНК, изолированных от FFPE тканей, предлагая более выраженный химическая модификация. Кроме того более высокие значения Ct для длинный по сравнению с короткой ампликонов являются показателем для мРНК фрагментации. В сравнении склонах значение Ct ампликон различных длин показывает, что более выраженными мРНК фрагментации в FFPE чем NCFPE ткани (рис. 3). Рисунок 2: представитель результаты HER2 рыбы для соответствующего формалин фиксированной парафин встроенные (FFPE) и не кросс ссылок, формалин бесплатно фиксированной парафин-врезанных разделов ткани (NCFPE). Приведены соответствующие примеры из же FFPE (A) и NCFPE (B) тканей. В отличие от обычных межфазной клетки (C), где два Грин (HER2) и две красные сигналы (CEN17), как ожидается, клетки с усилителем Локус гена HER2 представляют несколько копий зеленый сигналов (HER2) (D). HER2 амплификации статус был в FFPE и после фиксированного секции NCFPE (A, B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: результаты анализа ПЦР в реальном времени обратной транскрипции, используется для контроля качества РНК. Оси: Для различных ампликон длин приведены значения Ct (цикл порог) гена GAPDH (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) на оси x. мРНК был изолирован от FFPE и NCFPE двух различных груди Рак образцов ткани обрабатываются параллельно и транскрипции для cDNA для ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Результаты демонстрируют два ключевых выводов. Во-первых простой 24 h SBFS шаг после фиксации секций, вырезанные из NCFPE тканей достаточно получить эквивалентные результаты для тех, кто FFPE в рыбы анализа с использованием рыбы анализов, утвержденных для ткани FFPE (см. также ссылка¹⁴). Этот протокол имеет преимущество использования рыбы анализов первоначально разработана и утверждена для FFPE без необходимости в повторной проверке всеобъемлющего (например, оптимизации условий предварительного гибридизации для кросс несвязанном ткани). Точно так, как описано в инструкции завода-изготовителя может использоваться протокол рыбы.

Незначительные изменения от manufacturer´s инструкциям, описанным в этот протокол (например ткани раздел диаметр и инкубации периодов на шаги, депарафинизации) результат от предыдущих адаптации, которая явно рекомендованный производителем за счет использования различных тканей типы и методы фиксации.

После фиксации шаг очень важен, потому что он требует химической реакции время 18-24 ч, который расширяет время анализа на один день, но позволяет же ежедневных рабочих процессов, разработанных для FFPE ткани (рис. 1). SBFS, как сообщается, проникает в ткани в среднем 1 мм за²² часа до 5 мм в 2 ч в зависимости от ткани типа²³^,²⁴. Наблюдения, что только после фиксации длительного более чем 18 h может изменить свойства NCFPE в FFPE секции, указывает, что не проникновения фиксатором, но время химической реакции критически важное значение для достижения желаемых результатов¹ ^,¹⁴.

Во-вторых остальные NCFPE ткани, которая не используется для после фиксации может использоваться для дальнейшего молекулярного анализа как биомолекул хорошо сохранились. Это было продемонстрировано в реальном времени обратной транскрипции ПЦР (рис. 3). Assay более чувствительной, чем electropherogram производные Рин значение (РНК целостности номер) в отношении качества РНК (т.е., химическая модификация и фрагментации) для мРНК, изолированных от парафин врезанных тканей⁸. Контроль качества был ограничен в этом исследовании для ПЦР в реальном времени, так как независимые группы показали, что в дополнение к РНК, качество ДНК и белков, изолированных от NCFPE лучше, чем из FFPE тканей ⁸^,⁹^, ¹³.

Протокола, представлены следующим образом, где это применимо (например, SBFS рецепт, фиксации условий, РНК контроль качества, проверка), требования CEN технических спецификаций для предварительно аналитических процедур для in vitro диагностики (ИВД), которые недавно выпустила Европейского комитета стандартизации (ЕКС) (например CEN/TS 16827-1:2015 для РНК-изоляция из FFPE ткани, которая относится к стандарту ISO 15189).

Этот метод ограничен этой конкретной фиксатором. Хотя в нескольких исследованиях была представлена хорошо сохранение биомолекул и морфологии, используя не кросс ссылок, формалин бесплатные фиксатором, он в основном используется в научных исследованиях, но не в обычной медицине. Одной из причин является, что замена золотой стандарт SBFS фиксации по другим фиксатором потребует различных исследований проверки как не все протоколы, оптимизированный для FFPE материал может быть использован для материалов с не кросс ссылок фиксаторы. Другие методы фиксации ткани, не были проверены для этой рыбы протокола.

Простой шаг после фиксации, описанные в этой рукописи имеет преимущество использования IVD одобрил анализы как для FFPE и NCFPE тканей.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим команды в лаборатории молекулярной патологии в Институт патологии медицинского университета Граца для их знания и поддержку. Кроме того мы благодарим Iris Kufferath и Daniela Пабст для оказания технической помощи, Бернадетт Rieger и Сильвия Eidenhammer для обработки случаев HER2 а также Kinga Szurian (патологоанатома) и Тамас Regényi (3DHISTEC). Мы благодарим Пенелопа Kungl за корректуру рукопись. Эта работа финансовую поддержку Кристиан Допплер научный фонд, Австрийское федеральное министерство науки, исследований и экономики и Национальный фонд для научных исследований, технологий и развития.

Materials

SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany	www.sav-lp.de	FN-200L-4-1	Tissue fixative
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada	www.simport.com	M-498	Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765112	For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	813150	Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
Merck Millipore, Munich, Germany	www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html	MC1009834000	Dehydration of tissue samples
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany	https://at.vwr.com	10293EP	Dehydration of tissue samples
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria	www.herba-chemosan.at	2549662 32	Paraffin used in a tissue processing device
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria	www.LeicaBiosystems.com	39602004	Paraffin embedding medium
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria	www.sanova.at	5229	Paraffin embedding instrument for tissues for histology
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria	www.histocom.info	M 910010	This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark	www.chem.agilent.com	K802021-2	Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	73504	For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765134	For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany	www.zytovision.com	Z-2015-200	For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
3DHISTEC, Budapest, Hungary	www.3dhistech.com		Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4368814	The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4367659	PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE	www.thermofisher.com	Ser. Nr. F239	Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System	www.thermofisher.com	4485701	PCR machine,
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A	www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order	e.g. (ThermoBrite) 07J91-020	Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

References

Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O’Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714 (2013).
Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704 (2011).
Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
Applied Biosystems. . QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , (2013).
NCCLS. . Quality Assurance for Immunocytochemistry. , (1999).
Baker, J. R. . Principles of Biological Microtechnique. , (1958).
Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

Automatically Generated