HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

グラーツ医科大学 (参照番号 20-066)、倫理委員会で承認された研究オーストリア。組織サンプルは、患者が書面によるインフォームド コンセントを与えた後切除主な浸潤性の乳癌の 2 例から得られました。 1. ティッシュの固定 注: 組織の固定は実行標準緩衝ホルマリン ソリューション (リン酸カルシウム) のいずれかを 10% ホルマリン溶液 ph 6.8 ph 7.2 CEN/TS によるとバッファー 3.7% (4% の体積に対応する) ホルムアルデヒドの質量割合として定義されています。16827-1:2015 または (以下固定の代替ソリューションとも呼ばれる) 非相互リンク、無料のホルマリン組織固定システム定着剤と室温 (RT) で手ふれ補正ソリューションから成る。 十分な組織量を確保するため各 4 mm の 2 つの半分に胸滅菌メスでがん組織サンプルをカットします。NCFPE やリン酸カルシウムの組織固定用 4 × 15 × 15 mm の最大サイズを使用します。 標準組織カセット内腫瘍標本の各半分を置き、リン酸カルシウムまたは 4 つの部分の定着剤および一部組織 (4 mL/1 g 組織 (理想的には 10 mL/1 g)) の体積比 (v/v) あたりのボリュームで 24 時間の代替の固定の解決で水没します。 コンテナーを開いて、180 ° によって組織カセットを回して、それを沈める 2 72 h のスタビライザー ソリューションにまた固定サンプルを転送します。 残留リン酸カルシウムを削除する RT で 30 分間 250 mL 70% エタノールにリン酸カルシウム固定サンプル組織カセットを配置します。注: この手順は、生体分子の保全のため非クロス リンク定着剤の有益な特性を破壊するだろう自動化されたティッシュ プロセッサでの定着剤処理サンプルの非十字リンクのリン酸カルシウムの汚染を防止することが重要です。注意: リン酸カルシウム危険なソリューションは、皮膚刺激性、眼に対する重篤な損傷を引き起こす、アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります、遺伝的欠陥の原因の疑いがある、がん、呼吸器の炎症、臓器に眠気と原因の損傷を引き起こす可能性があります。代替の定着剤は吸入、皮膚に接触すると有毒飲み込んだ場合、飲み込んだ場合、目や皮膚、吸入、皮膚との接触を介して非常に深刻な不可逆効果の危険性への刺激と。どちらのソリューションでも固定の吸入と物理的な接触を避けてください。適切な防護服、手袋、眼と顔の保護を着用します。発煙のフードで働いてください。 ティッシュの処理の埋め込み、およびティッシュの区分 (セクション 2 および 3) に進みます。 2. ティッシュの処理と埋め込み 70% (2 × 15 分)、80% (30 分)、90% (60 分)、99% (2 x 60 分) エタノール、キシレン (2 x 60 分) の順で固定ティッシュ サンプル組織カセットの段階的な脱水を実行します。自動組織プロセッサ (4 × 45 分) のパラフィン浸透します。 鉗子を使用して、配置、脱水とパラフィン浸透のサンプル (または、リン酸カルシウム固定) 金型で。 サンプルを埋め込む 5-10 mL 溶融パラフィン (凝固点 56-58 ° C) パラフィン包埋を使用して計測器します。 -5 ° c で 30 分間冷却プレート金型を配置します。 金型からパラフィン埋め込まれたティッシュのブロックを回復します。 結果ブロックを保存 (または固定パラフィン (NCFPE)、リン酸カルシウム固定パラフィン (FFPE)) 使用するまで 4 ° C で暗闇の中。 3. 組織区分およびスライド準備魚 注: 魚の手順の前に 24 時間の NCFPE セクションのスライドを後リン酸カルシウムで固定されています。 FFPE セクションは、魚の使用直接。 ミクロトームに使い捨てブレードを挿入し、10 μ m にミクロトームを調整します。 冷却板から最初のブロックを取るし、測定器に挿入します。 均一な表面が得られるまでブロックをトリムします。ブラシを使用してミクロトームをきれいにし 2-3 の最初のセクションの破棄は、3 μ m にそれを調整します。 NCFPE と FFPE のブロックの 3 μ m のセクションをカットし、冷水浴 (純水) に配置します。注: 重複する核なしより良い写真を得るためには、ここでは、manufacturer´s 命令で推奨されている 3-5 μ m ではなく 2 μ m セクションの画像が表示されます。 フローティング各部細かいペイント ブラシと組織切片接着コーティング顕微鏡スライド上に針を拾います。 このスライドに突入 (40 ° C) 暖かい水のお風呂、完全にストレッチ セクション。 水のスライドを慎重に引いて、スライドにセクションを置くし、しわを避けるため。 すべてのセクションが 1 時間常温で乾燥させてください。 パラフィンを溶かすインキュベーターで 30 分間 70 ° C でスライドを加熱します。 ガラスの瓶を染色で水平方向にスライドを置きます。 Rehydrate 250 ml 以下の液体の満たされた染色瓶に RT で段階的なセクション: 100% キシレン 2 x 15 分、96% エタノール 2 x 15 分、90% エタノール 80% エタノール 70% エタノール、50% エタノールの 2 分 2 分 2 分 2 分、し、蒸留した水を 2 x 10 分。注意: ヒューム フードの退避と deparaffinization の手順を実行します、発生の有毒な溶剤を吸入しません。注: セクション、組織によって必要があります異なるインキュベーション時間を事前にテストします。 4. ポスト固定 NCFPE 標本の 24 h 後固定段階右場所ヒューム フードの瓶で 24 h のリン酸カルシウムで満ちている新しい染色瓶にそれらを置くことによって NCFPE スライドのポスト固定を実行します。 リン酸洗浄することにより削除過剰なリン酸カルシウムは緩衝生理食塩水 (3 x 10 分) と蒸留水 (2 x 10 分)。 5. 蛍光現場の交配 (魚) 注: ここで魚が市販の HER2/CEN17 デュアル カラー プローブ キットを使用して、製造元の指示に従って実行されます。組織切片をハイブリダイゼーションと洗浄の手順中に乾燥するようにしてください。DNA プローブと 4’、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA 対比染色ソリューション光に長時間さらされることはできません。暗闇の中でこれらの手順を実行します遮光容器を使用しています。年齢、サンプル素材の固定ステップによって変性を増減し、良い交配の結果を得るための温度を洗います。 場所染色瓶 250 mL 熱前処理ソリューション 98 ° C の水浴中にクエン酸にはが含まれています。 補給 FFPE を配置して 15 分間インキュベート後固定 NCFPE jar ファイルにスライドします。Jar を染色あたり六つ以上のスライドを使用しないでください。 新しい染色瓶に RT で 3 分間蒸留水でスライドを洗います。 37 ° C で温度制御の交配システムにスライドを配置、タンパク質分解の すぐに、適用、-使えるにペプシン溶液 (2 mg/ml) 滴下 (~ ドロップあたり 30 μ l) ティッシュ セクションそれが完全に覆われるまでに。ハイブリダイゼーション システムで 37 ° C で 9 分間インキュベートします。注: インキュベーション時間 5-15 分をお勧めします。タンパク質分解に最適な時間を事前に望まれます。 スライドを洗浄バッファー SSC を含む jar ファイルに置き、5 分間インキュベートします。 室温 1 分の蒸留水でスライドをすすいでください。 次の傾斜アルコール中でのセクションの脱水を実行: 50%、70%、90%、100 %1 分空気の乾燥のセクション。 ピペット 10 μ L 乾燥切片に HER2/CEN17 プローブの交配のため、coverslip で各サンプルをカバーし、ラバー セメントでそれを封印します。注: 22 × 22 mm 組織領域ごとには、プローブの 10 μ L の使用をお勧めします。プローブの穏やかな温暖化とピペッティングのプロセスが容易になります。泡と光へのプローブの長い露出を避けてください。 共同 75 ° C、10 分間で交配システムのプローブと試料 DNA を変化させなさい。 ハイブリダイゼーション システムを 37 ° C に設定し、一晩交配させます。 ポスト交配・検出用鉗子でゴム セメントを慎重に取り外します。 染色瓶含む 37 ° C で加温 1 x 洗浄バッファー A 5 分削除のスライド、coverslips を孵化させなさい。 スライドを使用して加温 1 x 洗浄バッファー A 37 ° C で 5 分間 2 回洗浄 70%、90%、100% エタノール、1 分のスライドを脱水します。 空気のサンプルを乾燥し、光から保護します。 染色の適用 30 μ L の泡を回避する交配させられた領域に DAPI ソリューション。観察のセクションをカバーしてください。 光から保護されて 15 分間インキュベートします。 フィルター ペーパーの間にスライドをそっと押して過剰の DAPI 溶液を慎重に取り外します。 共焦点顕微鏡による評価までに最大 2 週間は暗闇の中での 2-8 ° C でスライドを保存します。 6. 共焦点イメージングと魚スライドのスキャン 共焦点イメージングおよび共焦点デジタル スキャナー 40 x 搭載でスライドのスキャンを実行/1.2 NA 目的、クワッド バンド フィルター (DAPI、FITC、TRITC、Cy5)、5.5Mpx、16 ビット冷却科学相補的金属酸化物半導体 (CMOS) カメラ。 グリーンのフィルターで画像を取得 (励起: 503 nm、発光: 528 nm) とオレンジ (励起: 547 nm、発光: 572 nm) チャンネル。 7. 解釈 注: HER2/CEN17 プローブは赤色螢光色素標識 CEN17 特定のプローブ染色体 17 のアルファ衛星セントロメア領域 (D17Z1) とグリーン螢光色素標識 HER2 特定のプローブ HER2 遺伝子 (プローブの場所 17q12) の混合物。核当り HER2:CEN17 比なの腫瘍の標本は、HER2:CEN17 比 ≥2.0 とのそれらを増幅17として獲得しているに対し、通常通り採点されています。 オープン ソースの CaseViewer 2.120と画像の品質解析を実行します。 侵襲癌病理学者によって定義されたコンポーネントの 2 つの異なる地域にある少なくとも 20 セルを評価します。カウント領域で明確に区別も分散核があります。組織収縮または絞り地と境界領域をカウントから除外します。 8. RNA の品質 RNA の抽出 すべての機器とツールが RNAse フリーであることを確認します。RNAse 除去のソリューションを使用します。 3.8 のステップまでプロトコルに従うミクロトームを使用して NCFPE または FFPE サンプルの 10 に 20 セクション (厚み 5 μ m) をカットします。 NCFPE から RNA を抽出 RNA の隔離を使用してサンプル キット (材料の表を参照してください)。FFPE RNA 抽出用キットを用いた FFPE サンプルから RNA を抽出します。注: 非クロス リンク定着剤からの RNA の抽出には、固定法に適応した分離メソッドが必要です。その他 RNA 分離の方法 (例えば Trizol、RNeasy FFPE、NCFPE 試験片など) を使用しないでください。 RNA 濃度と純度分光光度計を使用して決定します。260 で吸光度の比 nm と 280 nm (A260/280) をする必要があります 〜 2.0。 さらに分析まで-70 ° C で隔離された RNA を保存します。 実行グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) リアルタイム逆転写 PCR プライマーを使用して異なる長さ8,9の産物を生成します。 CDNA 合成用 manufacturer´s 指示に従って cDNA 逆のトランスクリプション キットを使用します。各サンプルの 500 の ng RNA を使用します。さらに使用するまで-20 ° C で cDNA を格納します。 Manufacturer´s の指示に従って PCR マスター ミックスを準備します。 384 ウェル反応板トリプリケートで PCR マスター ミックスをピペットします。追加 4 μ L 1:16 の希釈 cDNA (PCR テンプレート)。Manufacturer´s の指示に従って PCR を実行します。注: 人間の GAPDH の次のプライマーを用いて: GAPDH 前方: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´;GAPDH 逆: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´、153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´、200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´、323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´、530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´。 PCR マシンに該当するソフトウェアを使用して結果を分析します。無指定の製品は、融解曲線分析21に基づいて除外する必要があります。