Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Martina Loibner; Lisa Oberauner-Wappis; Christian Viertler; Daniel Groelz; Kurt Zatloukal

doi:10.3791/55885

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

بروتوكول ل HER2 الأسماك باستخدام مثبت أنسجة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين للجمع بين مزايا الحفاظ على البرد والتثبيت الفورمالين

Published: December 25, 2017

doi:

10.3791/55885

Martina Loibner^1,2, Lisa Oberauner-Wappis^1,2, Christian Viertler², Daniel Groelz³, Kurt Zatloukal^1,2

¹Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology,Medical University Graz, ²Institute of Pathology,Medical University Graz, ³Research and Development,Qiagen GmbH

Summary

الأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) مطلوب غالباً في تركيبة مع الأنسجة والتشخيص الجزيئي لاختيار العلاج في الطب شخصية. مثبت أنسجة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين رواية تسمح عالية الجودة، والسمات الجزيئية وتحليلات للأسماك من نفس العينة بإضافة خطوة بعد انتهاء التثبيت قبل تقديمها الأسماك.

Abstract

تقييم السمات الثابتة الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين عينات الأنسجة (FFPE) المعيار الذهبي لتشخيص السرطان منذ عقود بسبب الحفاظ عليها الممتاز من التشكل. الطب شخصية متزايدة يوفر العلاجات تكييف فردي والمستهدفة للأمراض الفردية تتسم مكن الجمع بين التكنولوجيات التحليلية المورفولوجية والجزيئية وتشخيص. أداء الاختبارات الجزيئية والسمات من نفس العينة FFPE تحديا بسبب الأثر السلبي الفورمالين بسبب التعديل الكيميائي والعابرة للربط من الأحماض النووية والبروتينات. تم مؤخرا تطوير مثبت أنسجة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين للوفاء بكل الاحتياجات، أي، للحفاظ على مورفولوجيا مثل فب والجزيئات الحيوية مثل البرد–الحفاظ على. حيث غالباً ما يلزم الأسماك في تركيبة مع الأنسجة والتشخيص الجزيئي، قمنا باختبار إمكانية تطبيق البروتوكولات الأسماك على أنسجة تعامل مع هذا مثبت جديد. وجدنا أن التثبيت الفورمالين بعد مقاطع نسيجية غير-الصليب-ربط، خالية من الفورمالين وجزءاً لا يتجزأ من البارافين (نكفبي) الثدي سرطان الأنسجة التي تم إنشاؤها بما يعادل نتائج تلك مع الأنسجة FFPE في مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2) تحليل الأسماك. هذا البروتوكول توضح كيف يمكن استخدام مقايسة السمك وضعت أصلاً والتحقق من صحتها للأنسجة FFPE للأنسجة نكفبي بخطوة بعد انتهاء تثبيت بسيطة من أقسام النسيجي.

Introduction

الطب شخصية متزايدة تعتمد على اختبارات متعددة المعلمة التي تشمل تحاليل الأنسجة الجزيئية والمورفولوجية. التثبيت الفورمالين من الأنسجة كمعيار الذهب يوفر نوعية ممتازة مورفولوجك¹^،². ومع ذلك، تعديل المواد الكيميائية الناجمة عن الفورمالين والعابرة للربط للبروتينات والأحماض النووية³^،^،من⁴⁵ سلبا يتداخل مع التحليل الجزيئي⁶. هذه التعديلات الجزيئية تحد من نوعية الأحماض النووية والبروتينات، وقد يؤدي إلى تسلسل الجين المصنوعات اليدوية⁷ أو أقل حساسية لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)-على أساس فحوصات⁸. على الرغم من الجهود الرئيسية التي اتخذت لتحسين الاختبارات الجزيئية للأنسجة FFPE، من البرد–الحفاظ على الأنسجة في العليا العام للتثبيت الفورمالين، مما يجعل من الضروري تقسيم عينات الأنسجة للحفاظ على مختلف الإجراءات. لتجنب الحاجة إلى حفظ البرد للتحليلات الجزيئية، غير-الصليب-ربط، خالية من الفورمالين مثبت، باكسجيني الأنسجة وضعت. يتكون هذا النظام متاح تجارياً لتثبيت واستقرار محلول يحتوي على الكحول المختلفة، وحامض الخليك ومركب عضوي قابل لذوبان. وأبدى عدة دراسات⁶^،^،من⁹¹⁰^،¹¹^،^،من¹²¹³الحفاظ على السليم من الأحماض النووية والبروتينات (فوسبو) ومورفولوجيا.

هو تطبيق خاص واحد في تشخيص السرطان الأسماك الكشف عن مجموعة شاملة من التعديلات الكروموسومات، مثل المولدة والحذف سوبميكروسكوبيك وإيضاحات مسهبة ¹⁴. على سبيل المثال، تظهر عشرين في المئة أورام سرطان الثدي الغازية تضخيم مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2) الجينات¹⁵^،^،من¹⁶¹⁷، الذي يرتبط بسوء التشخيص¹⁸ ^،¹⁹. تحديد وضع HER2 overexpression والتضخيم في سرطان الثدي بالأسماك هناك حاجة لتحديد المرضى للعلاج الموجهة المضادة-HER2 وهو مصاحب تشخيصية المدرجة بالاتحادية المخدرات رابطة (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)¹⁷. من أجل السماح تطبيق التشخيص القائم على الأسماك رفيق على نطاق واسع في مجال الرعاية الصحية، ووضعت فحوصات والموافق عليها للأنسجة FFPE.

في دراسة سابقة، أظهر لنا أنه لا يمكن استخدام أنسجة نكفبي لفحوصات الأسماك التي تم قبولها للأنسجة FFPE. ومع ذلك، اختبارات الزمن بعد سلسلة من إجراءات تثبيت وظيفة مختلفة من الأنسجة نكفبي مع 4% مخزنة فورمالدهايد أظهرت أن مرات التثبيت 18 ساعة أو أطول من أقسام الأنسجة نكفبي حققت نتائج تعادل تلك مع الأنسجة FFPE¹⁴.

في هذه الدراسة، ونحن نقدم بروتوكول مفصل وإثبات مخزنة أثر الأنسجة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين التثبيت و 24 ح 4% فورمالدهايد بعد انتهاء التثبيت على الأقسام المستخدمة لنوعية الأسماك HER2، والجيش الملكي النيبالي من نفس العينة الأنسجة الأولية.

رقم 1: رسم تخطيطي يوضح الخطوات الخاصة بالأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) وتحليل الحمض النووي الريبي الفورمالين الثابتة البارافين مضمن (FFPE) وعدم الربط بين الصليب، خالية من الفورمالين البارافين ثابت مضمن الأنسجة (نكفبي)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

تمت الموافقة الدراسة لجنة الأخلاقيات التابعة “جامعة غراتس الطبية” (مرجع رقم 20-066)، النمسا. تم الحصول على عينات الأنسجة من حالتين من سرطان الثدي الغازية الأولية مستأصل جراحيا بعد أن يعطي المرضى الموافقة الخطية. 1-الأنسجة التثبيت ملاحظة: إجراء الأنسجة يتم التثبيت أما بمحلول الفورمالين المخزن القياسي (سبفس)، ويعرف محلول فورمالين 10% يحتوي على جزء شامل من فورمالدهايد 3.7% (المقابلة لكسر وحدة تخزين 4%) مخزنة للأس الهيدروجيني 6.8 للرقم الهيدروجيني 7.2 وفقا للشبكة/TS 16827-1:2015 أو نظام تثبيت الأنسجة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين (المشار إليها أيضا كحل بديل التثبيت أدناه) تتألف من مثبت وحل مثبت في درجة حرارة الغرفة (RT). قطع الثدي السرطان عينات الأنسجة مع مشرط معقم إلى نصفين كل 4 مم لضمان كمية كافية من الأنسجة. استخدام حجم أقصى 4 × 15 × 15 مم لتثبيت الأنسجة نكفبي أو سبفس. ضع كل نصف العينة ورم في كاسيت أنسجة قياسية وتغرق في سبفس أو الحل البديل تثبيت ح 24 بحجم وحدة التخزين نسبة (v/v) مثبت 4 أجزاء وجزء واحد الأنسجة (الأنسجة مل 4/1 غرام (من الناحية المثالية 10 مل/1 ز)). نقل العينات الثابتة بدلاً من ذلك إلى حل مثبت ح 2-72 قبل فتح الحاوية، وتحول الكاسيت الأنسجة من 180°، وغمر أنه. وضع أشرطة الأنسجة مع عينات سبفس–الثابتة في 250 مل إيثانول 70% لمدة 30 دقيقة على RT لإزالة سبفس المتبقية.ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتجنب تلوث سبفس-عبر ربط غير مثبت تعامل العينات في المعالج الأنسجة الآلي، الذي من شأنه أن يدمر خصائص مفيدة لربط الصليب غير نسيجية للحفاظ على الجزيئات الحيوية.تنبيه: سبفس هو حل خطرة، يسبب تهيج الجلد، تلف العين خطيرة، قد يسبب رد فعل حساسية جلد، يشتبه في أنه يسبب العيوب الوراثية، قد يسبب السرطان، وتهيّج الجهاز التنفسي، النعاس وأسباب الأضرار التي لحقت بالأجهزة. مثبت بديل السمية بالاستنشاق، على اتصال بالجلد وإذا ابتلع، تهيج العينين والجلد، وخطر آثار خطيرة جداً لا رجعة فيه عن طريق الاستنشاق، على اتصال بالجلد وإذا ابتلع. وينبغي تجنب استنشاق والاتصال الجسدي لكل الحلول التثبيت. ارتداء ملابس واقية مناسبة، والقفازات، وحماية العين والوجه. ويعمل في غطاء دخان. المضي قدما لمعالجة الأنسجة والتضمين وتقطيع الأنسجة (المادتان 2 و 3). 2-الأنسجة المعالجة وتضمينها أداء الجفاف التدريجي من أشرطة الكاسيت الأنسجة مع عينات الأنسجة الثابتة في 70% (2 × 15 دقيقة) و 80% (30 دقيقة)، 90% (60 دقيقة) والإيثانول 99% (2 × 60 دقيقة)، تليها زيلين نفط (2 × 60 دقيقة). ثم التسلل مع البارافين في معالج نسيج الآلي (4 × 45 دقيقة). استخدام الملقط، مكان العينات المجففة وتسلل البارافين (بدلاً من ذلك وثابتة سبفس) في قوالب معدنية. تضمين هذه العينات باستخدام البارافين تضمين صك في 5-10 مل البرافين المنصهر (نقطة التجميد 56-58 درجة مئوية). وضع القوالب على لوحة تبريد في-5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أن تسترد كتل الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين القوالب. تخزين الكتل الناتجة (بدلاً من ذلك–الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (نكفبي) وجزءاً لا يتجزأ من البارافين ثابتة سبفس (FFPE)) في الظلام في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. 3-الأنسجة إعداد تمزيقها والشرائح للأسماك ملاحظة: فب مباشرة تستخدم المقاطع للأسماك، بينما الشرائح مع أقسام نكفبي هي بعد إصلاحها في سبفس 24 ساعة قبل الإجراء الأسماك. إدراج شفرة تستخدم مرة واحدة مبضع وضبط مبضع إلى 10 ميكرون. تأخذ أول كتلة من لوحة التبريد وإدراجه في الصك. تقليم الكتلة حتى سطح حتى يتحقق. مبضع استخدام فرشاة تنظيف وضبط على 3 ميكرومتر. تجاهل المقاطع الأولى في 2-3. قص 3 ميكرومتر المقاطع كتل نكفبي وفب ووضعها في حمام ماء بارد (ماء عالي النقاوة).ملاحظة: للحصول على أفضل الصور الفوتوغرافية دون نويات متداخلة، هنا، صوراً للمقاطع ميكرومتر 2 بدلاً من 3-5 ميكرون كما الموصى بها في التعليمات manufacturer´s ترد. تلتقط كل مقطع العائمة مع فرشاة طلاء غرامة وابرة إلى شريحة مجهر مغلفة للالتصاق أقسام الأنسجة. إغراق هذه الشريحة في الحارة (40 درجة مئوية) المياه حمام وترك المقطع تمتد تماما. وضع القسم مرة أخرى على الشريحة عن طريق سحب الشريحة خارج الماء بعناية وتجنب التجاعيد. السماح لجميع أقسام الجاف في حرارة الغرفة ح 1. الحرارة الشرائح عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة تذوب في البارافين. وضع الشرائح أفقياً في زجاج تلطيخ جرة. ترطيب المقاطع التدرجي في RT في الجرار المصبوغة مليئة 250 مل من السوائل التالية: 100% زيلين نفط 2 × 15 دقيقة، الإيثانول 96% 2 × 15 دقيقة، الإيثانول 90% 2 دقيقة، الإيثانول 80% 2 دقيقة، الإيثانول 70% 2 دقيقة، الإيثانول 50% 2 دقيقة ، والمقطر المياه 2 x 10 دقيقة.تنبيه: قم بالخطوات ديبارافينيزيشن والاماهه في غطاء دخان، ولا يستنشق المذيبات السامة المتطاير.ملاحظة: اعتماداً على الأقسام والأنسجة، قد تكون ضرورية لاختبار الحاضنات مختلفة مرات مقدما. 4-بعد انتهاء التثبيت للعينات نكفبي إجراء التثبيت بعد انتهاء الشرائح نكفبي بوضعها في جرة المصبوغة جديدة مليئة سبفس عن 24 ساعة في مكان الرايت الجرة في غطاء دخان خلال الخطوة التثبيت بعد 24 ساعة. سبفس إزالة الزائدة بالغسيل مع الفوسفات مخزنة المالحة (3 x 10 دقيقة) والمقطر المياه (2 × 10 دقيقة). 5-الأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) ملاحظة: هنا السمكية تتم باستخدام مسبار اللون المزدوج HER2/CEN17 المتاحة تجارياً طقم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. لا تسمح لأقسام الأنسجة الجافة خلال التهجين والغسيل الخطوات. عدم السماح مسبار الحمض النووي و 4 ‘، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) الحمض النووي كونتيرستين الحلول للتعرض للضوء لفترة أطول. اتبع هذه الخطوات في الظلام باستخدام حاويات معتمة. تبعاً للسن وخطوة التثبيت المواد عينة، زيادة أو نقصان يشوه ويغسل درجات الحرارة للحصول على نتائج أفضل بالتهجين. ضع جرة المصبوغة التي تحتوي على 250 مل من الحرارة قبل العلاج الحل الستريك في حمام مائي 98 درجة مئوية. ضع فب ريهيدراتيد ونكفبي بعد الثابتة الشرائح في الجرة واحتضانها لمدة 15 دقيقة.لا تستخدم أكثر من ست شرائح تلطيخ جرة. يغسل الشرائح في الماء المقطر لمدة 3 دقائق في RT في جرة المصبوغة جديدة. بروتيوليسيس، وضع الشرائح في نظام تهجين درجة حرارة التي تسيطر على 37 درجة مئوية. فورا بتطبيق حل بيبسن-جاهزة للاستخدام (2 مغ/مل) دروبويسي (~ 30 ميليلتر كل قطره ماء) إلى مقاطع الأنسجة حتى تغطي تماما. احتضانها ل 9 دقيقة عند 37 درجة مئوية في نظام التهجين.ملاحظة: ينصح فترة حضانة من 5-15 دقيقة. الوقت الأمثل ل proteolysis ينبغي التحقق مسبقاً. ضع الشرائح في جرة تحتوي على المخزن المؤقت ليغسل SSC واحتضان لمدة 5 دقائق. شطف الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة في الرايت أداء جفاف المقاطع في كحول متدرج التالية: 50%، 70%، 90% و 100% كل للحد الأدنى 1 الهواء الجاف للفروع. التهجين، ماصة 10 ميليلتر من مسبار HER2/CEN17 على أقسام الأنسجة المجففة، تغطي كل عينة مع ساترة وختم ذلك بالأسمنت المطاطي.ملاحظة: من المستحسن 10 ميليلتر من التحقيق كل منطقة الأنسجة 22 × 22 مم. الاحترار لطيف المسبار يسهل عملية بيبيتينج. تجنب الفقاعات والتعرض الطويل للتحقيق للضوء. شارك تؤذي المسبار وعينات الحمض النووي في نظام التهجين على 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تعيين نظام التهجين إلى 37 درجة مئوية وهجن بين عشية وضحاها. بعناية إزالة الأسمنت المطاطي مع الملقط بعد التهجين والكشف عنها. احتضان الشرائح في المصبوغة جرة تحتوي على 37 درجة مئوية قبل استعد 1 x يغسل مخزن مؤقت أ لأدنى 5 إزالة في كوفيرسليبس. أغسل قبل استعد الشرائح باستخدام x 1 يغسل المخزن المؤقت A مرتين لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. يذوي الشرائح في الإيثانول 70%، 90% و 100%، 1 دقيقة. الجاف للعينات في الهواء وحماية من الضوء. لتلوين، تطبيق 30 ميليلتر DAPI-حل لمنطقة المهجن تجنب الفقاعات. وتغطي الأجزاء مع ساترة. احتضان لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. بعناية إزالة الحل DAPI الزائدة عن طريق الضغط بلطف الشريحة بين أوراق عامل التصفية. تخزين الشرائح في 2-8 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى أسبوعين حتى التقييم عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. 6-[كنفوكل] التصوير والمسح الضوئي لشرائح السمك أداء [كنفوكل] التصوير والمسح الضوئي للشرائح على ماسح ضوئي [كنفوكل] مزودة بعلامة x 40/1.2 غ الهدف، رباعية الفرقة مرشحات (DAPI/فيتك/تريتك/Cy5) و 5.5Mpx، 16 بت، مبرد العلمي أكسيد معدني متمم (CMOS) الكاميرا. الحصول على الصور مع عوامل التصفية للأخضر (الإثارة: 503 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات: 528 nm) والبرتقال (الإثارة: 547 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات: 572 nm) قنوات. 7-الترجمة الشفوية ملاحظة: التحقيق HER2/CEN17 خليط من أحمر المسمى فلوروتشرومي CEN17 تحقيق محددة لمنطقة سينتروميريك الفضائية ألفا من كروموسوم 17 (D17Z1) وأخضر المسمى fluorochrome HER2 تحقيق محددة للجين HER2 (المسبار الموقع 17q12). وسجل عينات الورم مع ≤2.0 نسبة HER2:CEN17 كل نواة كالمعتاد، بينما تلك مع ≥2.0 نسبة HER2:CEN17 وسجل ك تضخيم17. القيام بتحليل نوعية الصور مع المصدر المفتوح 2.1 كاسيفيوير20. تقييم 20 على الأقل من الخلايا التي تقع في منطقتين مختلفتين من العنصر الغازية لسرطان كما يحددها أخصائي. وتشمل الأنوية موزعة جيدا يمكن تمييزها الواضح في منطقة العد. استبعاد من عد مناطق الأنسجة على الحدود والمناطق تراجع أو تقلص. 8-الجيش الملكي النيبالي الجودة استخراج الحمض النووي الريبي ضمان أن جميع الصكوك والأدوات هي رناسي مجاناً. استخدام حل إزالة رناسي. قطع المقاطع 10 إلى 20 (سميك 5 ميكرومتر) من عينات نكفبي أو فب باستخدام مبضع بعد على البروتوكول حتى الخطوة 3.8. استخراج الحمض النووي الريبي من نكفبي عدة عينات باستخدام عزل الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد). استخراج الحمض النووي الريبي من عينات فب باستخدام مجموعة مواد عزل “الحمض النووي الريبي فب”.ملاحظة: تتطلب استخراج الحمض النووي الريبي من المصفف-عبر ربط غير أسلوب عزل تتكيف مع أسلوب التثبيت. لا تستخدم أي الحمض النووي الريبي العزل طريقة أخرى (مثل تريزول، فب رنيسي، إلخ للعينة نكفبي). تحديد تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء باستخدام جهاز المطياف الضوئي. نسبة امتصاص في 260 nm و 280 نانومتر (A260/280) ينبغي أن تكون ~ 2.0. تخزين الجيش الملكي النيبالي معزولة في-70 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل. أداء جليسيرالديهيدي 3-الفوسفات نازعة (جابده) في الوقت الحقيقي عكس نسخ PCR باستخدام كبسولة تفجير لتوليد أمبليكونس أطوال مختلفة8،9. استخدام أدوات نسخ عكسي كدنا وفقا لتعليمات manufacturer´s لتوليف كدنا. استخدام 500 نانوغرام الحمض النووي الريبي لكل عينة. تخزين كدنا في-20 درجة مئوية إلى استخدامها مرة أخرى. إعداد مزيج PCR الرئيسية وفقا لتعليمات manufacturer´s. “الماصة؛” مزيج PCR الرئيسي في تريبليكاتيس في لوحة رد 384-جيدا. إضافة 4 ميليلتر من 01:16 المخفف كدنا (PCR القالب). إجراء PCR وفقا لتعليمات manufacturer´s.ملاحظة: جابده البشرية، كبسولة تفجير التالية استخدمت: جابده قدما: 5´-ككاكاتكجكتكاجاكاككات-3´؛ عكس جابده: 71 شركة بريتيش بتروليوم 5´-أككاجكجكككاتاكج-3´، 153 bp 5´-جتااككاتجتاجتجاجتك-3´، 200 شركة بريتيش بتروليوم 5´-تجاكجتجككاتجاتت-3´، 277 bp 5´-أكتتجاتتتجاججاتكت-3´، 323 bp 5´-آجاكجككاجتجاكتككا-3´ و 530 بي بي 5´-أكجاتاككااجتجتكاتج-3´. تحليل النتائج باستخدام برمجيات المطبقة على الجهاز PCR. يجب استبعاد المنتجات غير محدد استناداً إلى ذوبان منحنى التحليل21.

Representative Results

تصميم HER2 الأسماك: كثافة إشارة HER2-الأسماك من فب ونكفبي هي مماثلة (الشكل 2). كلتا الحالتين في معظم الخلايا تظهر فائض واضحة الإشارة الخضراء (تشير إلى تضخيم موضع الجين HER2) بالمقارنة مع إشارة حمراء (CEN17 مرجع الجينات). ولذلك، تظهر القضية تضخيم جين HER2، مما يعني أن هذا المريض من المتوقع أن تستجيب إلى تراستوزوماب، علاج المضادة-HER2 استهدفت. بمثابة العينة FFPE مراقبة إيجابية. الإشارات التي لوحظت في الخلايا غير الورمية (سواء في فب أو نكفبي) بمثابة مرجع داخلي والمراقبة السلبية لتضخيم الجين HER2. لكل سلسلة التحليل، ينبغي استخدام قسم واحد على الأقل مع حالة التضخيم الجيني المعروفة كمراقبة إيجابية لرد فعل التهجين. الجيش الملكي النيبالي الجودة: عينات فب المقابلة ونكفبي من حالتين من حالات مختلفة تظهر اختلافات في نوعية الجيش الملكي النيبالي باستخدام PCR الوقت الحقيقي عكس النسخ. النتائج التي تم الحصول عليها إظهار الكفاءة التضخيم مختلفة لأطوال مختلفة أمبليكون (أي 71 شركة بريتيش بتروليوم، 153 شركة بريتيش بتروليوم، 200 شركة بريتيش بتروليوم، 275 شركة بريتيش بتروليوم، 323 bp) من مرناً جابده. جميع الأشعة المقطعية (دورة العتبة) القيم التي تم الحصول عليها من عينات FFPE كانت أعلى من تلك التي من نكفبي. يوضح هذا الفرق أمبليفيكابيليتي بكر أقل من مرناً المعزولة من الأنسجة FFPE، اقتراح تعديل المواد كيميائية أكثر وضوحاً. وعلاوة على ذلك، تكون القيم Ct أعلى لفترة طويلة بالمقارنة مع أمبليكونس قصيرة مؤشرا لتجزئة مرناً. وبالمقارنة، يبين منحدرات أطوال مختلفة amplicon قيمة الأشعة المقطعية أكثر وضوحاً تجزئة مرناً في فب مما نكفبي الأنسجة (الشكل 3). رقم 2: نتائج الممثل من الأسماك HER2 للمقابلة الفورمالين الثابتة البارافين مضمن (FFPE) والبارافين الثابتة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين جزءا لا يتجزأ من أقسام الأنسجة (نكفبي)- يتم عرض عينات المقابلة من نفس الأنسجة FFPE (A) ونكفبي (ب). وعلى النقيض من الطور البيني العادية الخلايا (ج)، حيث من المتوقع اثنين إشارات (CEN17) الأحمر والأخضر هما (HER2)، تمثل الخلايا مع تضخيم موضع الجين HER2 نسخ متعددة من الإشارات الخضراء (HER2) (د). وكانت حالة التضخيم HER2 متطابقة في كل من فب والمقاطع نكفبي بعد الثابتة (أ، ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3: نتائج المقايسة PCR النسخ العكسي في الوقت الحقيقي استخدامها لمراقبة الجودة في الجيش الملكي النيبالي- المحور الصادي: تظهر القيم Ct (دورة العتبة) الجين جابده لأطوال مختلفة amplicon (71 شركة بريتيش بتروليوم، 153 شركة بريتيش بتروليوم، 200 شركة بريتيش بتروليوم، 275 شركة بريتيش بتروليوم، 323 bp) على المحور س. وكان مرناً معزولة من فب ونكفبي من عينات الأنسجة هما سرطان الثدي مختلفة المجهزة بالموازي ويدون لكدنا لبكر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وتبين النتائج اثنين من النتائج الرئيسية. أولاً، خطوة بسيطة 24 ساعة بعد انتهاء تثبيت سبفس أقسام قطع من الأنسجة نكفبي كافية للحصول على نتائج مكافئة لتلك مع فب في تحليلات الأسماك باستخدام فحوصات الأسماك المعتمدة للأنسجة FFPE (انظر أيضا المرجع¹⁴). ويمتاز هذا البروتوكول استخدام فحوصات الأسماك وضعت أصلاً والمعتمدة ل FFPE دون الحاجة إلى إعادة شاملة (مثلاً، عن طريق تحسين ظروف التهجين قبل غير مرتبطة عبر الأنسجة). يمكن استخدام البروتوكول السمك بالضبط كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة.

إجراء تعديلات طفيفة من التعليمات manufacturer´s الموصوفة في هذا البروتوكول (مثل الأنسجة قسم القطر وحضانة فترات في الخطوات ديبارافينيزيشن) نتيجة التعديلات السابقة، الذي يوصي بصراحة من جانب الشركة المصنعة بسبب استخدام أنواع مختلفة من الأنسجة وأساليب التثبيت.

الخطوة بعد انتهاء التثبيت حاسمة لأنها تتطلب وقت رد الفعل كيميائية ح 18-24، الذي يمتد وقت التحليل بيوم واحد ولكن يسمح نفس سير العمل اليومي، كما وضعت للأنسجة FFPE (الشكل 1). ويقال سبفس اختراق الأنسجة بمعدل 1 مم كل ساعة²² إلى 5 ملم في ح 2 تبعاً لنوع النسيج²³^،²⁴. ملاحظة أنه فقط بعد انتهاء التثبيت لفترات طويلة أكثر من 18 ح يمكن تغيير خصائص نكفبي للمقاطع فب، يشير إلى أن عدم التغلغل في مثبت ولكن وقت رد الفعل الكيميائية أمر حاسم لتحقيق النتائج المرجوة¹ ^،¹⁴.

ثانيا، يمكن استخدام الأنسجة نكفبي المتبقية التي لم تستخدم بعد انتهاء التثبيت لمزيد من التحليلات الجزيئية كما الجزيئات الحيوية يتم الحفاظ عليها جيدا. وتجلى هذا في الوقت الحقيقي النسخ العكسي بكر (الشكل 3). المقايسة أكثر حساسية وتحديداً من المستمدة من اليكتروفيروجرام رين القيمة (عدد سلامة الحمض النووي الريبي) فيما يتعلق بنوعية الحمض النووي الريبي (أي، تعديل المواد الكيميائية وتجزئة) مرناً المعزولة من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين⁸. مراقبة الجودة كان يقتصر في هذه الدراسة على PCR الوقت الحقيقي نظراً للمجموعات المستقلة أظهرت أن نوعية الحمض النووي والبروتينات المعزولة من نكفبي أفضل من ذلك من الأنسجة FFPE ⁸^،⁹^، بالإضافة إلى الجيش الملكي النيبالي، ¹³.

بروتوكول المعروضة فيما يلي، حسب الاقتضاء (مثل وصفه سبفس، شروط التثبيت، مراقبة الجودة في الجيش الملكي النيبالي، التحقق من الصحة)، ومتطلبات المواصفات التقنية تجمع للإجراءات التحليلية السابقة للتشخيص في المختبر (IVD)، قد أفرج مؤخرا باللجنة الأوروبية للتوحيد القياسي (الشبكة) (مثل س/TS 16827-1:2015 للجيش الملكي النيبالي والعزل من الأنسجة FFPE الذي يشير إلى المعيار ISO 15189).

الأسلوب الذي يقتصر على هذا مثبت محددة. على الرغم من أن قد قدم جيدة الحفاظ على الجزيئات الحيوية ومورفولوجيا استخدام مثبت-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين في العديد من الدراسات، وهي تستخدم أساسا في مجال البحوث ولكن ليس في التطبيقات الطبية الروتينية. واحد الأسباب أن استبدال معيار الذهب سبفس التثبيت بمثبت آخر تتطلب مجموعة متنوعة من الدراسات التحقق من الصحة كما يمكن استخدام ليست كافة البروتوكولات الأمثل للمواد فب للمواد الثابتة مع المصفف-عبر ربط. لم يتم اختبار أساليب التثبيت الأنسجة الأخرى لهذا البروتوكول الأسماك.

الخطوة بعد انتهاء التثبيت بسيطة الموصوفة في هذه المخطوطة لها ميزة استخدام فحوصات عبد الموافقة للأنسجة FFPE ونكفبي.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر فريق مختبر علم الأمراض الجزيئية في معهد علم الأمراض “جامعة غراتس الطبية” لخبرتهم والدعم. وعلاوة على ذلك، نشكر كوفيراث آيريس وبابست دانييلا للمساعدة التقنية، برناديت ريجر وسيلفيا ايدينهاممير لمعالجة الحالات HER2، فضلا عن سزوريان كينغا (الطبيب الشرعي) وتاماس Regényi (3DHISTEC). ونحن نشكر “كونجل بينيلوب” لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط. هذا العمل ماليا أيده صندوق أبحاث دوبلر المسيحية والوزارة الاتحادية النمساوية للعلوم، والأبحاث والاقتصاد والمؤسسة الوطنية للبحوث والتكنولوجيا والتنمية.

Materials

SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany	www.sav-lp.de	FN-200L-4-1	Tissue fixative
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada	www.simport.com	M-498	Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765112	For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	813150	Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
Merck Millipore, Munich, Germany	www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html	MC1009834000	Dehydration of tissue samples
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany	https://at.vwr.com	10293EP	Dehydration of tissue samples
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria	www.herba-chemosan.at	2549662 32	Paraffin used in a tissue processing device
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria	www.LeicaBiosystems.com	39602004	Paraffin embedding medium
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria	www.sanova.at	5229	Paraffin embedding instrument for tissues for histology
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria	www.histocom.info	M 910010	This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark	www.chem.agilent.com	K802021-2	Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	73504	For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765134	For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany	www.zytovision.com	Z-2015-200	For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
3DHISTEC, Budapest, Hungary	www.3dhistech.com		Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4368814	The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4367659	PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE	www.thermofisher.com	Ser. Nr. F239	Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System	www.thermofisher.com	4485701	PCR machine,
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A	www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order	e.g. (ThermoBrite) 07J91-020	Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

References

Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O’Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714 (2013).
Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704 (2011).
Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
Applied Biosystems. . QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , (2013).
NCCLS. . Quality Assurance for Immunocytochemistry. , (1999).
Baker, J. R. . Principles of Biological Microtechnique. , (1958).
Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

Automatically Generated