Protocole pour HER2 pêcher avec un fixateur de tissu Non-cross-linking, formol à combiner les avantages de Cryo-préservation et Fixation au formol

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Graz (référence numéro 20-066), Autriche. Des échantillons de tissus ont été prélevés de deux cas de cancers du sein invasif primaire réséqués chirurgicalement après que les patients avaient donné consentement éclairé. 1. fixation du tissu Nota : Tissus fixation est effectuée soit avec une solution standard de formol tamponné (RAOUDHA), définie comme solution de 10 % de formol contenant une fraction massique de 3,7 % (correspondant à une fraction volumique de 4 %) de formaldéhyde tamponnée à pH 6,8 à pH 7,2 selon CEN/TS 16827-1:2015 ou le système de fixation de tissu non-cross-linking, formol (aussi dénommé la solution de rechange fixation ci-dessous) consistant en un fixateur et une solution de stabilisateur à température ambiante (RT). Couper la poitrine avec un scalpel stérile des échantillons de tissus de cancer en deux moitiés chaque 4 mm d’épaisseur pour assurer la quantité suffisante de tissu. Utilisez une taille maximale de 4 x 15 x 15 mm pour la fixation du tissu NCFPE ou RAOUDHA. Placez chaque moitié de l’échantillon de la tumeur dans une cassette de tissu standard et il immergez-la dans RAOUDHA ou la solution de fixation alternative pendant 24 h avec un volume par rapport de volume (v/v) de fixateur de 4 pièces et une partie des tissus (4 mL/1 g de tissu (idéalement 1 g/10 mL)). Transférer les échantillons d’alternativement-fixé dans la solution de stabilisateur pendant 2-72 h par ouvrir le conteneur, en tournant la cassette de tissu de 180° et submergeant. Placer les cassettes de tissu avec les échantillons de RAOUDHA-correction dans 250 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 min à ta supprimer RAOUDHA résiduelle.Remarque : Cette étape est importante pour éviter la contamination de RAOUDHA de non-cross-linking des échantillons traités fixateur dans le processeur de tissus automatisés, qui détruirait les propriétés bénéfiques de non-cross-linking fixatifs pour la préservation des biomolécules.ATTENTION : RAOUDHA est une solution dangereuse, provoque des irritations de la peau, des lésions oculaires graves, peut-être causer une réaction allergique cutanée, est susceptible de provoquer des anomalies génétiques, peut causer le cancer, irritation des voies respiratoires, somnolence et causes des dommages aux organes. L’autre fixateur est toxique par inhalation, par contact avec la peau et en cas d’ingestion, irritant pour les yeux et la peau, danger d’effets irréversibles très graves par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Inhalation et le contact physique doivent être évités pour les deux solutions de fixation. Porter un vêtement de protection approprié, des gants et protection oculaire et faciale. Travailler sous une hotte. Procéder au traitement de tissus, enrobage et découpe de tissus (sections 2 et 3). 2. traitement tissus et incorporation Effectuer une déshydratation progressive des cassettes de tissu avec les échantillons de tissu fixe à 70 % (2 x 15 min), 80 % (30 min), 90 % (60 min), et l’éthanol à 99 % (2 x 60 min), suivie de xylène (2 x 60 min). Puis infiltrer avec de la paraffine dans un processeur de tissus automatisés (4 x 45 min). À l’aide de pinces, placer les échantillons déshydratés et s’est infiltré dans la paraffine (alternativement et RAOUDHA-fixe) dans des moules métalliques. Incorporer les échantillons en paraffine fondue 5-10 mL (point de solidification 56-58 ° C) en utilisant un enrobage de paraffine instrument. Placer les moules sur une plaque de refroidissement à-5 ° C pendant 30 min. Récupérer les blocs de paraffine tissus de moules. Stocker les blocs qui en résulte (alternativement-fixe, paraffine (NCFPE) et la paraffine RAOUDHA-fixe (FFIP)) dans l’obscurité à 4 ° C jusqu’à l’utilisation. 3. tissu sectionnement et diapositive préparation de poisson NOTE : FFIP sections sont directement utilisées pour le poisson, tandis que diapositives avec des sections NCFPE post résolus dans RAOUDHA pendant 24 h avant la procédure de poissons. Insérez une lame à usage unique dans le microtome et réglez le microtome à 10 µm. Prenez le premier bloc de la plaque de refroidissement et insérez-le dans l’instrument. Couper le bloc jusqu’à l’obtention d’une surface plane. Nettoyer le microtome à l’aide d’un pinceau et ajustez-la à 3 µm. jeter les premières sections 2-3. Coupes de 3 µm de blocs NCFPE et FFIP et placez-les dans un bain d’eau froide (l’eau ultrapure).Remarque : Pour obtenir les meilleures photographies sans noyaux qui se chevauchent, ici, image de 2 sections de µm au lieu de 3-5 µm tel que recommandé dans la notice de manufacturer´s sont affichées. Ramasser chaque section flottante avec un pinceau fin et une aiguille sur une lame de microscope couché pour l’adherence des coupes de tissus. Plonger cette diapositive dans une tiède (40 ° C) bain d’eau et laisser la section étirer complètement. Replacez la section sur la diapositive en tirant délicatement la lame hors de l’eau et éviter les faux plis. Laissez que toutes les sections sécher à température ambiante pendant 1 h. Faire chauffer les diapositives à 70 ° C pendant 30 min dans un incubateur pour faire fondre de la paraffine. Posez les lames horizontale dans un verre pot de coloration. Réhydrater les sections par étapes à la droite dans les cuves de coloration remplies de 250 mL chacun des liquides suivants : 100 % xylène 2 x 15 min, éthanol à 96 % 2 x 15 min, 90 % éthanol 2 min, 80 % éthanol 2 min, éthanol à 70 % 2 min, 50 % d’éthanol 2 min et distillée 2 x 10 min de l’eau.ATTENTION : Effectuez des opérations déparaffinage et réhydratation dans une hotte de laboratoire, ne pas inhaler des solvants toxiques volatilisés.Remarque : Selon les sections et les tissus, il peut être nécessaire tester le temps de différentes d’incubation à l’avance. 4. après fixation des spécimens NCFPE Effectuer après fixation des lames NCFPE en les plaçant dans un pot de coloration nouveau rempli de RAOUDHA pendant 24 h à RT. Place le bocal dans une hotte de laboratoire au cours de l’étape d’après fixation 24h. RAOUDHA excès enlever par lavage avec phosphate buffered saline (3 x 10 min) et (2 x 10 min) d’eau distillée. 5. hybridation in situ fluorescence (poisson) NOTE : Ici le poisson est réalisée en utilisant la sonde disponible dans le commerce du bicolore HER2/CEN17 Kit selon les instructions du fabricant. Ne laissez pas les sections de tissu à sécher pendant l’hybridation et étapes de lavage. Ne pas laisser la sonde ADN et 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ADN contre-colorant solutions pour être exposé à la lumière pendant une longue période. Effectuez ces opérations dans l’obscurité à l’aide de conteneurs opaque. Selon l’âge et l’étape de la fixation de l’échantillon, augmenter ou diminuer la dénaturation et températures pour obtenir les meilleurs résultats d’hybridation de lavage. Placer un pot de coloration contenant 250 mL de solution de prétraitement thermique citrique dans un bain d’eau de 98 ° C. Placez la FFPE réhydraté et NCFPE post fixe se glisse dans le bocal et incuber pendant 15 min.N’utilisez pas plus de six diapositives par pot de coloration. Laver les lames dans l’eau distillée pendant 3 min à ta dans un nouveau pot de coloration. Pour protéolyse, placer les lames dans un système d’hybridation de régulation de température à 37 ° C. Appliquer immédiatement, le-prêt-à-utiliser solution de pepsine (2mg/ml) goutte à goutte (~ 30 µl par goutte d’eau) pour les sections de tissu jusqu’à ce qu’elle soit complètement recouverte. Incuber pendant 9 min à 37 ° C dans le système d’hybridation.Remarque : Un temps d’incubation de 5 à 15 min est recommandé. Le moment optimal pour la protéolyse devrait être déterminé à l’avance. Les diapositives dans un bocal contenant du tampon de lavage SSC et incuber pendant 5 min. Rincer les lames dans l’eau distillée pendant 1 min à température ambiante. Effectuer la déshydratation des sections dans les alcools graduées suivantes : 50 %, 70 %, 90 % et 100 % chacun pour 1 min. Air sec les sections. Pour l’hybridation, prélever 10 µL de sonde HER2/CEN17 sur les coupes de tissus secs, couvrir chaque échantillon avec un lamelle couvre-objet et sceller avec du ciment de caoutchouc.Remarque : 10 µL de sonde est recommandé par zone de tissu de 22 x 22 mm. Un léger réchauffement de la sonde facilite le processus de pipetage. Éviter les bulles et longue exposition de la sonde à la lumière. Co-dénaturer sonde et échantillon d’ADN dans le système d’hybridation à 75 ° C pendant 10 min. Définir le système d’hybridation à 37 ° C et s’hybrident du jour au lendemain. Retirer délicatement la colle de caoutchouc avec une pince de poteau-hybridation et de détection. Incuber les lames dans une coloration jar contenant 37 ° C préchauffé 1 x lavage tampons A pendant 5 min. Retirez le couvre-objet. Laver les diapositives à l’aide de préchauffé 1 x lavage tampon A deux fois pendant 5 min à 37 ° C. Déshydrater les diapositives dans l’éthanol à 70 %, 90 % et 100 %, 1 min chaque. Sécher les échantillons dans l’air et protéger de la lumière. Pour la coloration, appliquez 30 µL DAPI-solution pour la zone hybridée en évitant les bulles. Couvrir les sections avec une lamelle. Incuber pendant 15 min, abri de la lumière. Retirez soigneusement les excès DAPI-solution en appuyant doucement sur la diapositive entre papiers filtres. Stocker les lames à 2-8 ° C dans l’obscurité pendant 2 semaines jusqu’à évaluation par microscopie confocale. 6. confocal d’imagerie et de numérisation de diapositives de poisson Effectuer d’imagerie confocale et la numérisation des diapositives sur un scanner numérique confocal équipé d’un 40 x / 1.2 objectif de NA, quadri-bande filtres (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) et un 5.5Mpx, 16bits, refroidi caméra scientifique oxyde de métal complémentaire à semi-conducteurs (CMOS). Acquérir les images avec des filtres pour vert (excitation : 503 nm ; émission : 528 nm) et orange (excitation : 547 nm ; émission : 572 nm) canaux. 7. l’interprétation Remarque : La sonde HER2/CEN17 est un mélange d’une rouge marqué au fluorochrome CEN17 sonde spécifique pour la région centromérique alpha satellite du chromosome 17 (D17Z1) et une vert marqué au fluorochrome HER2 sonde spécifique du gène HER2 (sonde emplacement 17q12). Les échantillons de tumeur avec une ≤2. 0 du ratio de HER2:CEN17 par noyau sont marqués comme d’habitude, tandis que ceux avec un ratio de HER2:CEN17 ≥2. 0 sont marqués comme amplifié17. Effectuer une analyse de la qualité des images avec l’open source CaseViewer 2.120. Évaluer au moins 20 cellules qui sont trouvent dans deux régions différentes de la composante invasive de la carcinome tel que défini par un pathologiste. Inclure les noyaux bien réparties clairement distingués dans l’aire de comptage. Exclure du comptage des regions tissulaires à la frontière et les zones rétractées ou pressés. 8. ARN qualité Extraction de l’ARN S’assurer que tous les instruments et les outils sont RNAse librement. Utilisez une solution de RNAse-élimination. Couper des sections de 10 à 20 (5 µm d’épaisseur) de NCFPE ou FFIP échantillons à l’aide d’un microtome suivant le protocole jusqu’à l’étape 3,8. Extrait RNA NCFPE échantillons utilisant l’isolement nécessaire (voir la Table des matières). Extrait RNA échantillons FFPE en utilisant un kit d’isolation FFIP RNA.Remarque : L’Extraction d’ARN à partir de fixateurs non-cross-linking nécessite une méthode d’isolement adaptée à la méthode de fixation. Ne pas utiliser toute autre méthode d’isolement RNA (Trizol, RNeasy FFPE, etc. pour le spécimen de NCFPE). Déterminer la concentration d’ARN et de la pureté à l’aide d’un spectrophotomètre. Le rapport de la densité optique à 260 nm et 280 nm (A260/280) devrait être ~ 2.0. Conserver l’ARN isolé à-70 ° C jusqu’à l’analyse plus poussée. Effectuer une glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) en temps réel la transcription inverse PCR en utilisant des amorces pour générer des amplicons de différentes longueurs8,9. Utiliser un kit de transcription inverse ARNC conformément aux instructions de manufacturer´s pour la synthèse de cDNA. Utilisez 500 ng ARN de chaque échantillon. Conserver ADNc à-20 ° C jusqu’à l’utilisation ultérieure. Préparer le mélange maître PCR conformément aux instructions manufacturer´s. Déposer le mélange maître PCR en géométrie dans une plaque 384 puits de réaction. Ajouter 4 µL de 01:16 dilué cDNA (modèle PCR). Effectuer l’ACP conformément aux instructions manufacturer´s.Remarque : Pour GAPDH humaine, les amorces suivantes ont été utilisées : GAPDH vers l’avant : 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´ ; GAPDH inverse : bp 71 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, bp 153 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, bp 200 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, bp 277 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, bp 323 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ et 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´. Analyser les résultats à l’aide d’un logiciel applicable à la machine PCR. Produits non spécifiques doivent être exclues à l’issu de la fusion de courbe analyse21.