Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Martina Loibner; Lisa Oberauner-Wappis; Christian Viertler; Daniel Groelz; Kurt Zatloukal

doi:10.3791/55885

JoVE Journal > Cancer Research

Cancer Research

Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina

Published: December 25, 2017

doi:

10.3791/55885

Martina Loibner^1,2, Lisa Oberauner-Wappis^1,2, Christian Viertler², Daniel Groelz³, Kurt Zatloukal^1,2

¹Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology,Medical University Graz, ²Institute of Pathology,Medical University Graz, ³Research and Development,Qiagen GmbH

Summary

Hibridação in situ de fluorescência (FISH) é geralmente necessário em combinação com histopatologia e diagnóstico molecular para seleção da terapia na medicina personalizada. Um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol romance que permite alta qualidade morfológica, molecular e análises de peixes do mesmo espécime por adição de uma etapa pós-fixação antes de peixes é apresentado.

Abstract

Avaliação morfológica de amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE) tem sido o padrão-ouro para diagnóstico de câncer há décadas devido a sua excelente preservação da morfologia. Medicina personalizada cada vez mais fornece terapias individualmente adaptadas e direccionadas para caracterizadas doenças individuais habilitadas combinadas morfológicas e moleculares tecnologias analíticas e diagnósticos. Desempenho dos ensaios morfológicos e moleculares do mesmo espécime FFPE é um desafio devido ao impacto negativo de formol devido a modificação química e cross-linking de ácidos nucleicos e proteínas. Um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol foi recentemente desenvolvido para satisfazer ambos os requisitos, ou seja, para preservar a morfologia como FFPE e biomoléculas como crio-preservação. Desde que o peixe é geralmente necessário em combinação com histopatologia e diagnóstico molecular, testamos a aplicabilidade dos protocolos de peixe sobre os tecidos tratados com este novo fixador. Encontramos essa pós-fixação formol de cortes histológicos de não-cruz-ligação, livre de formol e parafina (NCFPE) mama câncer tecido gerado resultados equivalentes àqueles com tecido FFPE no receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) de 2 Análise de peixe. Este protocolo descreve como um ensaio de peixes originalmente desenvolvido e validado para o tecido FFPE pode ser usado para tecidos NCFPE por uma simples etapa pós-fixação de cortes histológicos.

Introduction

Medicina personalizada depende cada vez mais multiparâmetros testes envolvendo análises morfológicas e moleculares no tecido. Fixação de formol de tecidos como o padrão ouro fornece excelente qualidade morfológica¹^,². No entanto, a modificação química induzida por formalina e cross-linking de proteínas e ácidos nucleicos³^,⁴^,⁵ negativamente interfere com análise molecular⁶. Essas modificações moleculares limitar a qualidade dos ácidos nucleicos e proteínas e podem resultar em gene sequência artefatos⁷ ou sensibilidade reduzida da reação em cadeia da polimerase (PCR)-com base em ensaios de⁸. Embora grandes esforços foram tomados para otimizar os testes moleculares para tecido FFPE, crio-preservação de tecidos é em geral superior à fixação de formalina, tornando-se necessário dividir as amostras de tecido para procedimentos diferentes de preservação. Para evitar a necessidade de crio-preservação para análises moleculares, um não-cross-linking, livre de formol fixador, PAXgene tecido foi desenvolvido. Este sistema comercialmente disponível consiste de uma fixação e uma solução de estabilização contendo diferentes álcoois, ácido acético e um composto orgânico solúvel. Boa conservação dos ácidos nucleicos, proteínas (phospo) e morfologia foi mostrada em vários estudos⁶^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³.

Um aplicativo específico no diagnóstico de câncer é peixe detectar uma gama abrangente de alterações cromossômicas, como translocações, deleções submicroscópicas e amplificações ¹⁴. Por exemplo, vinte por cento dos tumores de câncer de mama invasivo mostrar amplificação do receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) gene¹⁵^,¹⁶^,,¹⁷, que está associada com mau prognóstico¹⁸ ^,¹⁹. Determinação do estatuto de superexpressão e amplificação do HER2 no câncer de mama por peixe é necessária para selecionar pacientes para a terapia anti-HER2-dirigido e é um complemento diagnóstico listado pelo Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)¹⁷. A fim de permitir uma ampla aplicação de diagnóstico complementar à base de peixe em cuidados de saúde, os ensaios foram desenvolvidos e aprovados para tecidos FFPE.

Em um estudo anterior, mostramos que os tecidos NCFPE não podem ser usados para ensaios de peixes que tenham sido aprovados para tecido FFPE. No entanto, testes de tempo série de post diferentes procedimentos de fixação de tecidos NCFPE com formol 4% tamponado, mostrou que postar os tempos de fixação de 18 h ou mais NCFPE seções do tecido alcançado resultados equivalentes àqueles com FFPE tecidos¹⁴.

Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado e demonstrar que o impacto de tecido não-cross-linking, livre de formol fixação e 24 h a 4% tamponado pós-fixação de formaldeído em seções usadas para qualidade HER2 peixe e RNA do mesmo espécime tecido primário.

Figura 1: diagrama mostrando as etapas de fluorescência em situ da hibridação (peixe) e análise de RNA de formalina fixada parafina incorporada (FFPE) e não-cross-linking, livre de formol fixa parafina incorporado tecidos (NCFPE). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

O estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da universidade médica de Graz (referência número 20-066), Áustria. Amostras de tecido foram obtidas de dois casos de cânceres de mama invasivo primário cirurgicamente ressecado depois que os pacientes tinham dado consentimento escrito. 1. fixação de tecidos Nota: Tecido a fixação é realizada também com solução de formalina tamponada padrão (SBFS), definido como solução de formol a 10%, contendo uma fração em massa de 3,7% (correspondente a uma fração de volume de 4%) formol tamponado para pH 6,8 a pH 7.2 de acordo com o CEN/TS 16827-1:2015 ou o sistema de fixação de tecido não-cross-linking, livre de formol (também referida como a solução de fixação alternativo abaixo) consiste em uma solução de estabilizador à temperatura ambiente (RT) e um fixador. Corte o peito de amostras de tecido de câncer com um bisturi estéril em duas metades cada 4 mm de espessura para garantir a quantidade adequada de tecido. Use um tamanho máximo de 4 x 15 x 15 mm para fixação de tecidos NCFPE ou SBFS. Coloque cada metade do espécime tumor em uma fita de tecido padrão e submirja em SBFS ou a solução alternativa de fixação para 24 h com um volume por relação de volume (v/v) do fixador 4 peças e uma parte do tecido (tecido (idealmente 10 mL/1 g)-4 mL/1 g). Transferi as amostras fixadas como alternativa para a solução de estabilizador para 2-72 h abertura do recipiente, rodando a fita de tecido em 180° e submergindo-lo. Coloque as fitas de tecido com as amostras SBFS-fixo em 250 mL de etanol a 70% por 30 min em RT para remover SBFS residual.Nota: Este passo é importante para evitar a contaminação de SBFS de amostras de tratados com fixador não-cross-linking no processador automático de tecidos, que destruiriam as propriedades benéficas do fixador não-cross-linking para preservação de biomoléculas.Atenção: SBFS é uma solução perigosa, provoca irritação na pele, lesões oculares graves, pode causar uma reação alérgica de pele, é suspeito de causar defeitos genéticos, podem causar câncer, irritação respiratória, sonolência e causa danos aos órgãos. O fixador alternativo é tóxico por inalação, em contacto com a pele e em caso de ingestão, irritante para os olhos e pele, perigo de efeitos irreversíveis muito graves por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. Inalação e contato físico devem ser evitados para ambas as soluções de fixação. Use vestuário de protecção adequado, luvas e proteção de olhos e da face. Trabalho em uma coifa. Proceda ao processamento do tecido, incorporação e corte de tecido (seções 2 e 3). 2. tecido processamento e incorporação Realizar a desidratação gradual de fitas de tecido com as amostras de tecido fixo em 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min), e álcool etílico 99% (2 x 60 min), seguido por xilol (2 x 60 min). Então se infiltre com parafina em um processador de tecido automatizado (4 x 45 min). Usando a pinça, coloque as amostras desidratadas e parafina-infiltrados (Alternativamente e SBFS-fixo) em moldes de metal. Incorporar as amostras em parafina derretida de 5-10 mL (ponto de solidificação 56-58 ° C) usando uma incorporação de parafina do instrumento. Coloque os moldes em uma placa de resfriamento a-5 ° C por 30 min. Recupere os blocos de parafina do tecido de moldes. Armazenar os blocos resultantes (Alternativamente-fixas, parafina (NCFPE) e SBFS-fixo parafina (FFPE)) no escuro a 4 ° C até o uso. 3. tecido de seccionamento e slide preparação para peixes Nota: FFPE seções diretamente são usadas para os peixes, enquanto slides com seções NCFPE pós-fixados em SBFS 24 h antes do procedimento de peixe. Inserir uma lâmina descartável no micrótomo e ajustar o micrótomo para 10 µm. Pegue o primeiro bloco da placa de resfriamento e inseri-lo dentro do instrumento. Apare o bloco até que seja alcançada uma superfície plana. Limpe o micrótomo usando um pincel e ajustá-lo a 3 µm. descarte as primeiras seções de 2-3. Seções de corte 3 µm de blocos NCFPE e FFPE e colocá-los em um banho de água fria (água ultrapura).Nota: Para obter melhores fotografias sem sobreposição de núcleos, aqui, imagens de 2 µm secções, em vez de 3-5 µm, conforme recomendado nas instruções de manufacturer´s são mostradas. Pegue cada seção flutuante com um pincel fino e uma agulha numa lâmina de microscópio revestido para adesão das secções de tecido. Mergulhe neste slide um quente (40 ° C) banho de água e deixe a seção esticar completamente. Volte a colocar a seção para o slide puxando cuidadosamente o slide fora da água e evitar rugas. Deixe secar à temperatura ambiente durante 1 h-todas as seções. Aqueça os slides a 70 ° C por 30 min em uma incubadora para derreter a parafina. Colocar as lâminas horizontalmente em um vidro frasco de coloração. Hidratar as seções gradual no RT nos potes de coloração preenchidas com 250 mL de cada dos seguintes líquidos: xileno 100% 2 x 15 min, etanol a 96% 2 x 15 min, 90% etanol 2 min, 80% de etanol 2 min, 2 min, 50% etanol etanol a 70% 2 min e destilada água 2 x 10 min.Atenção: Execute etapas deparaffinization e reidratação em uma coifa, não inalar solventes tóxicos volatilizados.Nota: Dependendo da seções e tecido, pode ser necessário testar diferentes incubações com antecedência. 4. pós-fixação de espécimes NCFPE Realizar pós-fixação de slides NCFPE colocando-os em um frasco de coloração novo cheio de SBFS por 24 h no lugar do RT. o frasco em uma coifa durante a etapa de pós-fixação 24 h. Remover excesso SBFS lavando com fosfato tampão salino (3 x 10 min) e (2 x 10 min) de água destilada. 5. fluorescência situ hibridação in (peixe) Nota: Aqui o peixe é executada usando a sonda de dupla cor HER2/CEN17 comercialmente disponível Kit de acordo com as instruções do fabricante. Não permita que as seções de tecido secar durante a hibridação e as etapas de lavagem. Não permita que a sonda de DNA e 4′, 6-diamidino-2-phenylindole soluções de corante de contraste (DAPI) DNA para ser exposta à luz durante um período mais longo. Execute estas etapas no escuro usando recipientes opacos. Dependendo da idade e a etapa de fixação do material de amostra, aumentar ou diminuir a desnaturação e lavar as temperaturas para obter melhores resultados de hibridização. Coloque um coloração frasco contendo 250 mL de solução de pré-tratamento de calor cítrica em um banho de água de 98 ° C. Coloque o FFPE re-hidratado e pós-fixados NCFPE desliza para dentro do frasco e incube por 15 min.Não use mais de seis slides por frasco de coloração. Lave as lâminas em água destilada por 3 min em RT em um novo frasco de coloração. Para proteólise, coloque os slides em um sistema de hibridização de temperatura controlada a 37 ° C. Aplique imediatamente, o ready-to-use solução de pepsina (2mg/ml), gota a gota (~ 30 µ l por gota) para as secções de tecido até está completamente coberto. Incube durante 9 min a 37 ° C no sistema de hibridização.Nota: Recomenda-se um tempo de incubação de 5-15 min. O tempo ideal para proteólise deve ser determinado antecipadamente. Coloque os slides em um frasco contendo tampão de lavagem SSC e incubar durante 5 min. Lavar as lâminas em água destilada por 1 min em RT Realizar a desidratação das seções nos seguintes álcoois classificados: 50%, 70%, 90% e 100% cada por 1 min. o ar seco as seções. Para a hibridação, pipeta de 10 µ l da sonda HER2/CEN17 para as seções de tecido seco, cubra cada amostra com uma lamela e selá-lo com cimento de borracha.Nota: recomenda-se 10 µ l de sonda por área de tecido de 22 x 22 mm. Um suave aquecimento da sonda facilita o processo de pipetagem. Evite bolhas e longa exposição da sonda para a luz. Co Desnature sonda e a amostra de DNA no sistema de hibridação em 75 ° C por 10 min. Definir o sistema de hibridação a 37 ° C e cruzar durante a noite. Remova cuidadosamente o cimento de borracha com fórceps para pós-hibridação e detecção. Incube os slides em um coloração jar contendo 37 ° C pré aquecido 1 x lavagem de tampão A 5 min. remover as lamelas. Lave os slides usando pré aquecido 1 x tampão de lavagem A duas vezes por 5 min a 37 ° C. Desidrate os slides em etanol a 70%, 90% e 100%, 1 min cada. Secar as amostras no ar e proteger da luz. Para a coloração, aplicar 30 µ l DAPI-solução para a área hibridizada evitando bolhas. Cobrir as seções com uma lamela. Incube durante 15 min, protegido da luz. Remova cuidadosamente o excesso de solução de DAPI pressionando suavemente o slide entre papéis de filtro. Armazene os slides a 2-8 ° C no escuro por até 2 semanas até a avaliação pela microscopia confocal. 6. confocal imaging e digitalização de slides de peixes Executar a imagem latente confocal e digitalização de slides em um scanner digital confocal, equipado com um x 40 / 1.2 objectivo at, filtros quad-band (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) e um 5.5Mpx, 16 bits, câmera de semicondutor (CMOS) científica de óxido metálico complementar de refrigeração. Adquirir as imagens com filtros para verde (excitação: 503 nm, emissão: 528 nm) e laranja (excitação: 547 nm, emissão: 572 nm) canais. 7. interpretação Nota: A sonda HER2/CEN17 é uma mistura de uma vermelho marcado com fluorocromo CEN17 sonda específica para a região centromérica satélite alfa do cromossomo 17 (D17Z1) e uma verde marcado com fluorocromo HER2 sonda específica para o gene HER2 (sonda localização 17q12). Amostras de tumor com um rácio de HER2:CEN17 ≤ 2.0 por núcleo são marcadas como normal, Considerando que aqueles com uma proporção de HER2:CEN17 ≥ 2.0 são marcados como amplificado17. Realizar análise de qualidade das imagens com o open source CaseViewer 2.120. Avalie pelo menos 20 células que estão localizadas em duas regiões diferentes do componente invasivo do carcinoma conforme definido por um patologista. Inclua claramente distinguíveis núcleos bem distribuídos na área de contagem. Exclua da contagem de regiões do tecido no limite e em áreas retraídas ou espremidas. 8. RNA qualidade Extração de RNA Certifique-se de que todos os instrumentos e ferramentas são RNAse livre. Use uma solução de RNAse-remoção. Seções de corte 10 a 20 (5 µm de espessura) de amostras NCFPE ou FFPE usando um micrótomo seguindo o protocolo até o passo 3.8. Extrair o RNA de NCFPE kit de amostras usando o isolamento de RNA (consulte a tabela de materiais). Extraia o RNA de amostras FFPE usando um kit de isolamento de RNA FFPE.Nota: Extração de RNA de fixadores não-cruz-ligação requer um método de isolamento adaptado ao método de fixação. Não utilize qualquer outro RNA isolamento método (por exemplo, Trizol, RNeasy FFPE, etc. para a amostra NCFPE). Determine a concentração de RNA e pureza usando um espectrofotômetro. A razão entre a absorvância a 260 nm e 280 nm (A260/280) deve ser ~ 2.0. Armazene o RNA isolado a-70 ° C até uma análise mais aprofundada. Executar uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em tempo real a transcrição reversa PCR utilizando primers para gerar amplicons de comprimentos diferentes8,9. Use um kit de transcrição reversa do cDNA de acordo com as instruções do manufacturer´s para a síntese do cDNA. Use 500 ng RNA de cada amostra. Loja do cDNA a-20 º C até utilização posterior. Prepare a mistura de mestre de PCR de acordo com as instruções do manufacturer´s. Pipete o mix de mestre de PCR em triplica em uma placa de reação 384-bem. Adicionar 4 µ l de 01:16 diluído do cDNA (modelo PCR). Realize o PCR de acordo com as instruções do manufacturer´s.Nota: Para GAPDH humana, os seguintes primers foram utilizados: GAPDH para a frente: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH reverso: 71 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´ da bp, bp 153 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, bp 323 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ e 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´. Analise os resultados usando um software aplicável à máquina de PCR. Produtos não específicos devem ser excluídos com base na análise de curva21a derreter.

Representative Results

Determinação do HER2 de peixe: As intensidades de sinal HER2-peixe da FFPE e NCFPE são semelhantes (Figura 2). Ambos os casos, na maioria das células mostram um claro excesso do sinal verde (indicativo do locus de gene HER2 amplificado) em comparação com o sinal vermelho (gene de referência CEN17). Portanto, o caso mostra um gene HER2 amplificado, o que significa que este paciente deve responder ao Trastuzumabe, uma terapia anti-HER2 direcionados. O espécime FFPE serviu como controle positivo. Os sinais observados nas células não-neoplásicos (tanto em FFPE e NCFPE) servem como referência interna e o controlo negativo para a amplificação do gene HER2. Para cada série de análise, pelo menos uma seção com status de amplificação de gene conhecido deve ser usada como controle positivo para a reação de hibridação. Qualidade do RNA: FFPE correspondente e NCFPE amostras de dois casos diferentes mostram diferenças na qualidade do RNA empregando transcrição reversa em tempo real do PCR. Resultados obtidos mostram eficiência de amplificação diferentes para comprimentos diferentes amplicons (i.e., 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) do mRNA GAPDH. Todos os valores de Ct (ciclo limiar) obtidos de amostras FFPE foram superiores aos de NCFPE. Essa diferença demonstra a amplificability PCR inferior do mRNA isolado de tecidos FFPE, sugerindo uma modificação química mais pronunciada. Além disso, os valores mais elevados de Ct por muito tempo comparado com amplicons curto são um indicador para a fragmentação do mRNA. Em comparação, as encostas de valor de Ct dos comprimentos diferentes amplicons mostra mais pronunciado fragmentação de mRNA em FFPE do que NCFPE os tecidos (Figura 3). Figura 2: resultados representativos de HER2 peixe para formalina correspondente fixada parafina incorporado (FFPE) e não-cross-linking, livre de formol parafina fixa incorporado cortes de tecido (NCFPE). Correspondentes amostras dos mesmos tecidos FFPE (A) e NCFPE (B) são mostradas. Em contraste com as células normais da interfase (C), onde dois verdes (HER2) e dois sinais de vermelho (CEN17) são esperados, células com locus de gene HER2 amplificado representam várias cópias de sinais verdes (HER2) (D). Status de amplificação do HER2 era idêntica em ambos FFPE e as seções NCFPE pós-fixas (A, B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: resultados de um ensaio PCR em tempo real transcrição reversa utilizado para controle de qualidade de RNA. Eixo y: Valores de Ct (limiar de ciclo) do gene da GAPDH são mostradas para comprimentos diferentes amplicons (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) no eixo x. mRNA foi isolado FFPE e NCFPE de duas amostras de tecido do câncer mama diferentes transformadas em paralelo e transcrito de cDNA para PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os resultados demonstram dois principais descobertas. Primeiro, um passo de pós-fixação SBFS simples 24h de seções de corte de tecidos NCFPE é suficiente para obter resultados equivalentes àqueles com FFPE nas análises de peixe utilizando ensaios de peixe aprovados para tecidos FFPE (Veja também referência¹⁴). Este protocolo tem a vantagem do uso de ensaios de peixes originalmente desenvolvido e aprovado para FFPE sem a necessidade de revalidação abrangente (por exemplo, através da otimização das condições pré-hibridização de tecido non-cross-linked). O protocolo de peixe pode ser usado exatamente como descrito nas instruções do fabricante.

Pequenas modificações das instruções manufacturer´s descritas no presente protocolo (por exemplo, tecido seção diâmetro e incubação períodos nas etapas a seguir deparaffinization) resultam adaptações anteriores, que é explicitamente recomendado pelo fabricante devido ao uso de tipos de tecido diferentes e métodos de fixação.

A etapa de pós-fixação é crítica, porque ele requer um tempo de reação químico de 18-24 h, que estende o tempo de análise, um dia, mas permite que o mesmo fluxo de trabalho diário, como desenvolvido para tecidos FFPE (Figura 1). SBFS é relatado para penetrar o tecido a uma taxa média de 1 mm por hora²² a 5 mm em 2 h, dependendo do tipo de tecido²³^,²⁴. A observação que somente pós-fixação de prolongada mais de 18 h pode alterar as propriedades de NCFPE seções FFPE, indica que não a penetração do fixador, mas o tempo de reação químico é fundamental para alcançar os resultados desejados¹ ^,¹⁴.

Em segundo lugar, o NCFPE o tecido remanescente que não é usado para pós-fixação pode ser usado para mais análises moleculares como as biomoléculas são bem preservadas. Isso foi demonstrado pela transcrição reversa em tempo real do PCR (Figura 3). O ensaio é mais sensível e específico do que o derivado electroferograma RIN valor (número de integridade do RNA) no que respeita à qualidade do RNA (i.e., modificação química e fragmentação) para mRNA isolado de tecidos parafina⁸. Controle de qualidade estava restrita neste estudo para PCR em tempo real, uma vez que grupos independentes demonstraram que, além de RNA, a qualidade de DNA e proteínas isoladas de NCFPE é melhor da FFPE tecidos ⁸^,⁹^, ¹³.

O protocolo apresentado segue, quando aplicável (por exemplo, receita SBFS condições de fixação, controle de qualidade de RNA, validação), os requisitos das especificações técnicas para procedimentos pré-analíticos para diagnóstico in vitro (IVD), CEN que têm sido recentemente lançado pelo Comité Europeu de normalização (CEN) (por exemplo, CEN/TS 16827-1:2015 para isolamento de RNA de tecidos FFPE que se refere à norma ISO 15189).

O método é limitado a este fixador específico. Embora a boa preservação das biomoléculas e morfologia usando o fixador não-cross-linking, livre de formol foi apresentada em vários estudos, é usado principalmente em pesquisa, mas não em aplicações médicas de rotina. Uma razão é que substituindo o padrão-ouro SBFS fixação por outro fixador que exigem uma variedade de estudos de validação, como nem todos os protocolos otimizados para material FFPE podem ser usados para materiais fixadas com fixador não-cross-linking. Outros métodos de fixação de tecidos não foram testados para este protocolo de peixe.

A etapa de pós-fixação simples descrita neste manuscrito tem a vantagem do uso de ensaios de IVD aprovado para tecidos FFPE e NCFPE.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a equipe do laboratório de patologia molecular no Instituto de patologia da universidade médica Graz por seus conhecimentos e apoio. Além disso, nós agradecemos Iris Kufferath e Daniela Pabst para assistência técnica, Bernadette Rieger e Sylvia Eidenhammer para processar os casos de HER2 bem como Kinga Szurian (patologista) e Tamas Regényi (3DHISTEC). Agradecemos Penelope Kungl revisão do manuscrito. Este trabalho tem sido apoiado financeiramente por Christian Doppler fundo de investigação, o Ministério Federal austríaco de ciência, pesquisa e economia e a Fundação Nacional de investigação, tecnologia e desenvolvimento.

Materials

SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany	www.sav-lp.de	FN-200L-4-1	Tissue fixative
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada	www.simport.com	M-498	Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765112	For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	813150	Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
Merck Millipore, Munich, Germany	www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html	MC1009834000	Dehydration of tissue samples
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany	https://at.vwr.com	10293EP	Dehydration of tissue samples
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria	www.herba-chemosan.at	2549662 32	Paraffin used in a tissue processing device
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria	www.LeicaBiosystems.com	39602004	Paraffin embedding medium
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria	www.sanova.at	5229	Paraffin embedding instrument for tissues for histology
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria	www.histocom.info	M 910010	This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark	www.chem.agilent.com	K802021-2	Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	73504	For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765134	For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany	www.zytovision.com	Z-2015-200	For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
3DHISTEC, Budapest, Hungary	www.3dhistech.com		Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4368814	The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4367659	PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE	www.thermofisher.com	Ser. Nr. F239	Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System	www.thermofisher.com	4485701	PCR machine,
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A	www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order	e.g. (ThermoBrite) 07J91-020	Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

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Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

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