Ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) è spesso necessaria in combinazione con l’istopatologia e diagnostica molecolare per la selezione della terapia in medicina personalizzata. Un fissativo di romanzo-cross-linking, privo di formalina tessuto che permette alta qualità morfologiche, molecolare e analisi dei pesci dallo stesso campione tramite l’aggiunta di un passaggio di post-fissazione prima di pesce è presentato.
Valutazione morfologica dei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE) è stato il gold standard per la diagnostica del cancro per decenni a causa della sua ottima conservazione della morfologia. Medicina personalizzata fornisce sempre più individualmente adattate e mirate terapie per malattie individuali caratterizzati abilitati da tecnologie combinate di analisi morfologiche e molecolare e diagnostica. Prestazioni di analisi morfologiche e molecolari dallo stesso campione di FFPE sono impegnativo a causa dell’impatto negativo di formalina a causa di modificazione chimica e cross-linking di acidi nucleici e proteine. Un fissativo tessuto-cross-linking, privo di formalina è stato recentemente sviluppato per soddisfare entrambi i requisiti, vale a dire, per preservare la morfologia come FFPE e biomolecole come crio-conservazione. Poiché il pesce è spesso necessaria in combinazione con l’istopatologia e diagnostica molecolare, abbiamo testato l’applicabilità dei protocolli di pesce sui tessuti trattati con questo nuovo fissativo. Abbiamo trovato quella post-fissazione formalina di sezioni istologiche dei non-cross-linking, privo di formalina e seno per (NCFPE) a paraffina cancro del tessuto generato risultati equivalenti a quelli con tessuto FFPE nel recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) Analisi dei pesci. Questo protocollo descrive come un saggio FISH originariamente sviluppato e validato per tessuto FFPE può essere utilizzato per tessuti NCFPE da una semplice fase di post-fissazione delle sezioni istologiche.
Medicina personalizzata si basa sempre più su test multi-parametro di analisi morfologica e molecolare del tessuto. Fissazione in formalina di tessuti come il gold standard fornisce eccellenti qualità morfologiche1,2. Tuttavia, modificazione chimica formalina-indotta e cross-linking delle proteine e acidi nucleici3,4,5 negativamente interferisce con l’analisi molecolare6. Queste modificazioni molecolari limitare la qualità di acidi nucleici e proteine e potrebbero gene sequenza manufatti7 o ridotta sensibilità della reazione a catena della polimerasi (PCR)-base di saggi8. Anche se gli sforzi principali sono state prese per ottimizzare i test molecolari per tessuto FFPE, cryo-conservazione di tessuti è in generale superiore alla fissazione in formalina, rendendo necessario dividere i campioni di tessuto per le procedure di conservazione diversi. Per evitare la necessità di cryo-conservazione per analisi molecolari, un non-cross-linking, privo di formalina fissativo, tessuto PAXgene è stato sviluppato. Questo sistema disponibile in commercio è costituito da una fissazione e una soluzione di stabilizzazione contenente diversi alcoli, acido acetico e un composto organico solubile. Buona conservazione degli acidi nucleici, proteine (defosforilata) e morfologia è stata indicata in parecchi studi6,9,10,11,12,13.
Una particolare applicazione nella diagnostica del cancro è pesce rilevare un’ampia gamma di alterazioni cromosomiche, come ad esempio traslocazioni, delezioni submicroscopiche e amplificazioni 14. Ad esempio, il venti per cento dei tumori del cancro al seno invasivo mostrano amplificazione del recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) gene15,16,17, che è associata con la prognosi difficile18 ,19. Determinazione dello status di sovraespressione e amplificazione di HER2 nel cancro al seno dai pesci è necessario per selezionare i pazienti per la terapia anti-HER2-diretto ed è uno strumento diagnostico elencato dalla Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. Al fine di consentire una vasta applicazione di test diagnostici di accompagnamento a base di pesce nella cura della salute, le analisi sono state sviluppate e approvate per tessuti FFPE.
In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che i tessuti NCFPE non possono essere utilizzati per analisi di pesce che sono state approvate per tessuto FFPE. Tuttavia, test di tempo serie di post differenti procedure di fissazione dei tessuti NCFPE con formaldeide 4% tamponato ha mostrato che pubblica i tempi di fissazione di 18 h o più delle sezioni del tessuto NCFPE raggiunti risultati equivalenti a quelli con FFPE tessuti14.
In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato e dimostrare che l’impatto del tessuto-cross-linking, privo di formalina fissazione e 24h 4% tamponata la post-fissazione formaldeide su sezioni usato per qualità del pesce di HER2 e RNA dallo stesso campione di tessuto primario.
Figura 1: diagramma che mostra i passaggi per ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) e analisi di RNA di formalina riparata paraffina (FFPE) e non-cross-linking, privo di formalina fisso paraffina incastonato tessuti (NCFPE). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I risultati dimostrano due risultati principali. In primo luogo, un passo di post-fissazione Raffaele semplice 24h di sezioni tagliate dai tessuti NCFPE è sufficiente per ottenere risultati equivalenti a quelli con FFPE in analisi dei pesci usando le analisi di pesce approvate per tessuti FFPE (veda inoltre riferimento14). Questo protocollo ha il vantaggio di usando le analisi pesce originariamente sviluppato e approvato per FFPE senza la necessità di riconvalida completa (ad es., ottimizzando le condizioni di pre-ibridazione per tessuto non-cross-linked). Il protocollo di pesce può essere utilizzato esattamente come descritto nelle istruzioni del produttore.
Modifiche minori dalle istruzioni del produttore descritte in questo risultato di protocollo (ad esempio tessuto sezione diametro e incubazione periodi presso i passaggi di sparaffinatura) da precedenti adattamenti, che è esplicitamente raccomandato dal produttore Grazie all’utilizzo di diversi tipi di tessuto e metodi di fissazione.
Il passaggio di post-fissazione è fondamentale perché richiede un tempo di reazione chimico di 18-24 h, che estende il tempo di analisi di un giorno, ma permette il flusso di lavoro quotidiano stesso come sviluppato per tessuti FFPE (Figura 1). Raffaele è segnalato per penetrare il tessuto ad un tasso medio di 1 millimetro al ore22 a 5 mm a 2 h a seconda del tipo di tessuto23,24. L’osservazione che solo lunghi periodi post-fissazione di più di 18 h potrebbero modificare le proprietà di NCFPE di sezioni FFPE, indica che non la penetrazione del fissativo ma il tempo di reazione chimico è fondamentale per raggiungere i risultati desiderati1 ,14.
In secondo luogo, il tessuto restante del NCFPE che non viene utilizzato per la post-fissazione utilizzabile per ulteriori analisi molecolari come le biomolecole sono ben conservate. Questo è stato dimostrato da trascrizione d’inversione Real-Time PCR (Figura 3). Il test è più sensibile e specifico rispetto al valore RIN elettroferogramma-derivato (numero di integrità di RNA) in materia di qualità di RNA (cioè, modificazione chimica e frammentazione) per mRNA isolato da tessuti paraffina-incastonati8. Controllo di qualità è stato limitato in questo studio a PCR in tempo reale poiché gruppi indipendenti hanno dimostrato che oltre a RNA, la qualità di DNA e proteine isolate dal NCFPE è migliore di quella da FFPE tessuti 8,9, 13.
Il protocollo presentato segue, ove applicabile (ad es., ricetta di Raffaele, condizioni di fissazione, controllo di qualità di RNA, convalida), i requisiti delle specifiche tecniche CEN per le procedure pre-analitiche per diagnostica in vitro (IVD), che sono stati recentemente rilasciati dal Comitato europeo di normalizzazione (CEN) (ad es. CEN/TS 16827-1:2015 per isolamento del RNA dai tessuti FFPE che si riferisce allo standard ISO 15189).
Il metodo è limitato a questo fissativo specifico. Anche se la buona conservazione delle biomolecole e morfologia utilizzando il fissativo-cross-linking, formalina-free è stata presentata in diversi studi, è usato principalmente nella ricerca, ma non in applicazioni mediche di routine. Uno dei motivi è che sostituendo il gold standard Raffaele fissazione da parte di un altro fissativo richiederebbe una varietà di studi di validazione come non tutti i protocolli ottimizzati per materiale FFPE possono essere utilizzati per materiali fissate con fissativi-cross-linking. Altri metodi di fissazione del tessuto non sono stati testati per questo protocollo di pesce.
Il semplice passaggio di post-fissazione descritto in questo manoscritto presenta il vantaggio di usando le analisi IVD approvato sia per tessuti FFPE e NCFPE.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il team del laboratorio di patologia molecolare presso l’Istituto di patologia dell’Università medica di Graz per la loro competenza e supporto. Inoltre, si ringraziano Iris Kufferath e Daniela Pabst per assistenza tecnica, Bernadette Rieger e Sylvia Eidenhammer per l’elaborazione di casi HER2 come pure Kinga Szurian (patologo) e Tamas Regényi (3DHISTEC). Vi ringraziamo di correzione di bozze del manoscritto Penelope Kungl. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da Christian Doppler ricerca del fondo, il Ministero federale austriaco della scienza, ricerca ed economia e Fondazione nazionale per ricerca e sviluppo tecnologico.
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ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4368814 | The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction. |
ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4367659 | PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons. |
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QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System | www.thermofisher.com | 4485701 | PCR machine, |
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