Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Martina Loibner; Lisa Oberauner-Wappis; Christian Viertler; Daniel Groelz; Kurt Zatloukal

doi:10.3791/55885

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

פרוטוקול עבור HER2 דגים באמצעות מקבע-קישור קרוס, ללא פורמלין רקמות כדי לשלב את היתרונות של הקפאה-שימור קיבוע פורמלין

Published: December 25, 2017

doi:

10.3791/55885

Martina Loibner^1,2, Lisa Oberauner-Wappis^1,2, Christian Viertler², Daniel Groelz³, Kurt Zatloukal^1,2

¹Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology,Medical University Graz, ²Institute of Pathology,Medical University Graz, ³Research and Development,Qiagen GmbH

Summary

קרינה פלואורסצנטית מקומיים הכלאה (דגים) נדרש לעיתים קרובות בשילוב עם histopathology ואבחון מולקולרי לבחירה של טיפול ברפואה אישית. מקבע הרומן רקמת-קישור קרוס, ללא פורמלין המאפשר באיכות גבוהה מורפולוגיות, מולקולרית וניתוחים דגים מן הדגימה זהה על ידי תוספת של שלב קיבוע שאחרי לפני דגים מוצג.

Abstract

הערכה מורפולוגיות של פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE) כבר תקן זהב עבור אבחון סרטן במשך עשרות שנים בשל שימור מעולה של מורפולוגיה. רפואה אישית מספק יותר ויותר טיפולים המותאמים באופן אינדיבידואלי יישוב מאופיין מחלות בודדות מופעל על-ידי טכנולוגיות אנליטי משולבות מולקולרית מורפולוגיים ואבחון. הביצועים של מבחני מורפולוגיות ומולקולרית של הדגימה FFPE אותו הוא מאתגר בגלל ההשפעה השלילית של פורמלין עקב שינוי כימי, cross-linking של חומצות גרעין וחלבונים. מקבע הרקמה הלא-קרוס-קישור, ללא פורמלין פותחה לאחרונה למלא שתי דרישות, קרי, כדי לשמר את המורפולוגיה כמו FFPE מולקולות כמו שימור-הקפאה. מאז דגים נדרש לעיתים קרובות בשילוב עם histopathology ואבחון מולקולרי, בדקנו תחולתה של דגים פרוטוקולים על רקמות שטופלו מקבע החדש הזה. מצאנו את קיבוע שאחרי זה פורמלין היסטולוגית חלקים שאינם-cross-linking, ללא פורמלין ותוצאות פרפין-מוטבע (NCFPE) השד סרטן רקמות שנוצר מקבילה לאלה עם רקמת FFPE האנושי גורם הגדילה באפידרמיס קולטן 2 (HER2) ניתוח דגים. פרוטוקול זה מתאר איך assay דגים במקור פותחה ואומת עבור רקמת FFPE יכול לשמש NCFPE לרקמות שלב קיבוע שאחרי פשוט סעיפים היסטולוגית.

Introduction

רפואה אישית יותר ויותר מסתמך על פרמטר ריבוי בדיקות מעורבים רקמות מולקולרי מורפולוגיים ניתוחים. פורמלין קיבוע של רקמות כמו תקן הזהב מספק איכות מורפולוגיות מעולה¹^,². עם זאת, פורמלין-induced שינוי כימי ו- cross-linking של חלבונים, חומצות גרעין³^,⁴^,⁵ שלילית מפריע אנליזה מולקולרית⁶. אלה שינויים מולקולריים להגביל את האיכות של חומצות גרעין וחלבונים והוא עלול לגרום ג’ין רצף חפצי אמנות⁷ או רגישות מופחתת של תגובת שרשרת פולימראזית (PCR)-לפי מבחני⁸. למרות מאמץ רב נלקחו כדי למטב את בדיקות מולקולריות FFPE רקמות, הקפאה-שימור הרקמות הוא כללי עדיפה על קיבוע פורמלין, ולכן יש צורך לפצל דגימות רקמה להליכי שימור שונים. כדי למנוע את הצורך שימור-הקפאה עבור ניתוחים מולקולריים, שאינם-cross-linking, ללא פורמלין מקבע, רקמת PAXgene פותחה. מערכת זו זמינים מסחרית מורכבת אובססיה פיתרון ייצוב המכיל כהלים שונים, חומצה אצטית, תרכובת אורגנית מסיסים. שימור תקין של חומצות גרעין, חלבונים (phospo), מורפולוגיה הראו מספר מחקרים⁶^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³.

יישום מסוים אחד באבחון סרטן הוא דגים בזיהוי מגוון מקיף של שינויים כרומוזומליות, כמו translocations, מחיקות submicroscopic ו- amplifications ¹⁴. לדוגמה, 20% של גידולים של סרטן שד פולשני להציג הגברה של הקולטן האנושי גורם הגדילה באפידרמיס 2 (HER2) גנים¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, אשר מזוהה עם פרוגנוזה גרועה¹⁸ ^,¹⁹. קביעת ביטוי HER2 ומצב הגברה בסרטן השד על ידי דגים יש צורך לבחור מטופלים לטיפול אנטי-HER2-בוים והוא לוויה אבחון מפורט על ידי הפדרלי סמים האגודה (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)¹⁷. על מנת לאפשר יישום נרחב של אבחון לוויה המבוססים דגים בשירותי הבריאות, מבחני היו פותח ואושר FFPE לרקמות.

במחקר הקודם, הראינו כי רקמות NCFPE אינם יכולים לשמש עבור מבחני דגים אשר אושרו על רקמות FFPE. עם זאת, בדיקות של זמן סדרת פוסט אחר הנהלים קיבוע של רקמות NCFPE עם 4% buffered פורמלדהיד הראה כי פוסט פעמים קיבוע של 18 h או יותר של מקטעי רקמת NCFPE מושגת התוצאות שוות ערך לאלה עם רקמות FFPE¹⁴.

במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט, להדגים שההשפעה של רקמות-קישור קרוס, ללא פורמלין קיבוע ו- 24 h 4% buffered פוסט-שנצמד מקטעים המשמש עבור איכות HER2 דגים ו- RNA מן הדגימה רקמות העיקרי באותו פורמלדהיד.

איור 1: דיאגרמה המציגה את השלבים עבור קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) וניתוח RNA של פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE)-קישור קרוס, פרפין קבוע ללא פורמלין מוטבע רקמות (NCFPE). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

המחקר אושרה על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של גראץ (אסמכתא מספר 20-066), אוסטריה. דגימות רקמה התקבלו שני מקרים של סרטן שד פולשני העיקרית בניתוח resected לאחר שהמטופלים נתן הסכמה בכתב. 1. רקמות קיבוע הערה: רקמת קיבעון היא לבצע גם עם פתרון פורמלין במאגר הרגיל (SBFS), מוגדרת כ 10% פורמלין, לאודנום שבריר המונית של 3.7% (תואם לשבר נפח של 4%) פורמלדהיד buffered ל pH 6.8 ל pH 7.2 לפי CEN/TS 16827-1:2015 או מערכת קיבוע הרקמה הלא-קרוס-קישור, ללא פורמלין (המכונה גם הפתרון קיבוע חלופי להלן) המורכב מקבע ופתרון מייצב בטמפרטורת החדר (RT). חותכים השד סרטן דגימות רקמה עם איזמל סטרילי לשני חצאים כל 4 מ מ עבה כדי להבטיח כמות רקמת נאותה. השתמש בגודל מרבי של 4 x 15 x 15 מ מ עבור קיבוע הרקמה NCFPE או SBFS. מניחים חצי אחד של הדגימה הגידול קלטת רקמות סטנדרטי ויציפו אותה SBFS או הפתרון קיבוע חלופי עבור 24 שעות עם אמצעי אחסון לכל יחס נפח (v/v) של חלקים 4 מקבע ורקמות חלק אחד (4 מ ל/1 גרם רקמה (אידיאלי 10 מ ל/1 g)). להעביר את הדגימות לחלופין-קבוע בתוך תמיסת מייצב עבור 2-72 h על-ידי פתיחת המכולה, מפנה את הקלטת רקמות ב- º 180, השוקע זה. מקום הקלטות רקמות עם הדגימות SBFS-קבוע 250 מ”ל אתנול 70% למשך 30 דקות ב- RT כדי להסיר שאריות SBFS.הערה: השלב זה חשוב למנוע זיהום SBFS-קישור בין דגימות שטופלו מקבע במעבד רקמות אוטומטיות, אשר ישמיד המועילות של הלא-קרוס-קישור כתות ומייצבים לשימור של מולקולות.התראה: SBFS הוא פתרון מסוכנים, גורם גירוי בעור, נזק עיניים חמורות, עלול לגרום לתגובה אלרגית בעור, הוא חשוד בגרימת פגמים גנטיים, עלולה לגרום לסרטן, גירוי בדרכי הנשימה, נמנום וגורם לנזקים לאיברים. מקבע חלופי הוא רעיל באמצעות אינהלציה, במגע עם העור, אם בלע, מעצבן את העיניים והעור, סכנה של תופעות בלתי הפיך רציני מאוד באמצעות אינהלציה, במגע עם העור, אם בלע. שאיפה ומגע גופני יש להימנע במשך שני פתרונות קיבעון. ללבוש ביגוד מגן מתאימים, כפפות והגנה העיניים והפנים. לעבוד בשכונה fume. המשך עיבוד רקמות, הטבעה, רקמות חלוקתה (סעיפים 2 ו- 3). 2. ברקמה והטבעה לבצע התייבשות stepwise רקמות קלטות עם דגימות רקמה קבוע ב- 70% (2 x 15 דקות), 80% (30 דקות), 90% (60 דקות), 99% (2 x 60 דקות) אתנול, ואחריו קסילן (2 x 60 דקות). ואז לחדור עם פרפין ב מעבד רקמות אוטומטיות (4 x 45 דקות). באמצעות מלקחיים, למקם את הדגימות מיובש, הסתננו פרפין (לחלופין, SBFS-קבוע) בתבניות מתכת. להטביע את הדגימות ב 5-10 מ”ל פרפין מותכת (נקודת התמצקות 56-58 מעלות צלזיוס) באמצעות הטבעה פרפין כלי נגינה. מניחים את התבניות שבהן על צלחת קירור ב-5 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לשחזר את גושי רקמה פרפין-מוטבע התבניות. לאחסן בלוקים וכתוצאה מכך (לחלופין-קבוע, פרפין-מוטבע (NCFPE) ו- SBFS-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE)) בחושך ב 4 ° C עד השימוש. 3. רקמות חלוקתה והחלק הכנה דגים הערה: סעיפים FFPE ישירות משמשים דגים, בעוד שקופיות עם מקטעים NCFPE קבועות פוסט ב- SBFS עבור 24 שעות לפני הליך דגים. להכניס סכין לשימוש יחיד האזמל הקטן ולהתאים את האזמל הקטן 10 מיקרומטר. לקחת את הרחוב הראשון מהצלחת קירור והוספתו לתוך המכשיר. חתוך את הבלוק עד במשטח מושגת. לנקות את האזמל הקטן בעזרת מברשת וכוונן אותו ל- 3 מיקרומטר. ביטול הסעיפים הראשונים 2-3. לחתוך 3 סעיפים מיקרומטר של בלוקים NCFPE ו- FFPE ומניחים בתוך אמבט מים קרים (הנדסה גנטית מים).הערה: כדי לקבל צילומים טובים יותר ללא גרעינים חופפים, כאן, תמונות של סעיפים 2 מיקרומטר במקום 3-5 מיקרומטר כמומלץ בהוראות manufacturer´s מוצגות. לאסוף את כל מקטע צף עם מברשת צבע יפה, מחט לשקופית מיקרוסקופ מצופה הדבקה של הסעיפים רקמות. טיבלו בשקופית זו חמה (40 ° C) רשמים ולתת את המקטע למתוח לגמרי. להחזיר את המקטע השקופית על ידי משיכת בקפידה את השקופית מחוץ למים, למנוע קמטים. תני כל המקטעים יבש בטמפרטורת החדר מאובטח. מחממים את השקופיות ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתוך אינקובטור להמיס הפרפין. לשים את השקופיות אופקית מכתים צנצנת זכוכית. נוזלים stepwise ב RT בצנצנות מכתימים הסעיפים מלא עם 250 מ ל כל אחד של נוזלים הבאים: 100% קסילן 2 x 15 דקות, אתנול 96% 2 x 15 דקות, 90% אתנול 2 דקות, 80% אתנול 2 דקות, אתנול 70% 2 דקות, 50% אתנול 2 דקות , מזוקק מים 2 x 10 דקות.התראה: לבצע צעדים deparaffinization, התייבשות בשכונה fume, לא לנשום ממיסים volatilized רעילים.הערה: בהתאם מקטעי רקמת, ייתכן צורך לבדוק הדגירה שונה פעמים מראש. 4. קיבוע שאחרי של דגימות NCFPE לבצע קיבוע שאחרי של שקופיות NCFPE על ידי ומכניסים אותם לתוך צנצנת מכתימים חדש מלא עם SBFS עבור 24 שעות במקום RT. הצנצנת בשכונה fume במהלך השלב קיבוע שאחרי 24 שעות ביממה. SBFS עודף להסיר בשטיפה עם פוספט buffered תמיסת מלח (3 x 10 דקות), לגלידה (2 x 10 דקות). 5. קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) הערה: כאן דגים מתבצעת באמצעות המכשיר צבע כפול HER2/CEN17 זמינים מסחרית ערכת בהתאם להוראות היצרן. אל תאפשר הסעיפים רקמות יבש במהלך הכלאה ושטיפת צעדים. אל תאפשר את בדיקת ה-DNA, 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) DNA counterstain פתרונות, להיחשף לאור לתקופה ארוכה יותר. בצע את השלבים הבאים בחושך באמצעות מכולות lightproof. בהתאם לגיל לשלב קיבוע של החומר לדוגמה, להגדיל או להקטין את denaturing ולא לכבס בטמפרטורות כדי להשיג תוצאות טובות יותר של הכלאה. המקום צנצנת מכתימים המכיל 250 מ של חום טיפול קדם פתרון לימון בתוך אמבט מים 98 ° C. מניחים את FFPE rehydrated, NCFPE פוסט-קבוע מחליק לתוך הצנצנת תקופת דגירה של 15 דקות.אל תשתמש יותר משישה שקופיות מכתימה את הצנצנת. לשטוף את השקופיות במים מזוקקים למשך 3 דקות ב RT בצנצנת מכתימים חדש. עבור proteolysis, למקם את השקופיות לתוך מערכת הכלאה מבוקרת טמפרטורה ב 37 º C. להחיל מיד, את מוכנה-לשימוש פפסין פתרון (2 מ”ג/מ”ל) dropwise (~ 30 µl לכל טיפה) על המקטעים רקמות עד זה מכוסה לגמרי. תקופת דגירה של 9 דקות ב 37 מעלות צלזיוס במערכת הכלאה.הערה: מומלץ זמן הדגירה של 5-15 דקות. הזמן האופטימלי עבור proteolysis צריך לקביעה מראש. למקם את השקופיות לתוך צנצנת שמכילה מאגר שטיפת האס, תקופת דגירה של 5 דקות. לשטוף את השקופיות במים מזוקקים למשך 1 דקות ב- RT. לבצע התייבשות של הסעיפים כהלים מדורגת הבאים: 50%, 70%, 90% ו 100% לכל 1 מינימלית אוויר יבש הסעיפים. של הכלאה, פיפטה 10 µL של HER2/CEN17 בדיקה על הסעיפים רקמות מיובשים, מכסה כל דגימה עם coverslip, לאטום אותו עם דבק גומי.הערה: µL 10 של בדיקה מומלצת לכל אזור הרקמה 22 x 22 מ מ. מחמם עדין של המכשיר מקל על התהליך pipetting. להימנע בועות חשיפה ארוכה של המכשיר אל האור. שיתוף denature החללית ואת דגימות DNA במערכת הכלאה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להגדיר את המערכת הכלאה 37 ° C, hybridize בין לילה. הסר בזהירות את הבטון גומי עם מלקחיים עבור הכלאה שלאחר וזיהוי. דגירה השקופיות במאגר מכתימים צנצנת המכילה 37 ° C מראש חימם 1 x שטיפת A עבור 5 דק. הסר את coverslips. תשטוף השקופיות בעזרת מראש חימם 1 x, שטיפת מאגר A פעמיים במשך 5 דקות ב 37 º C. מייבשים את השקופיות ב- 70%, 90% ל- 100% אתנול, 1 דקות. יבש את הדגימות באוויר, להגן מפני אור. עבור צביעת, חלים 30 µL דאפי-פתרון לאזור hybridized הימנעות בועות. מכסים הסעיפים עם coverslip. תקופת דגירה של 15 דקות מוגן מפני אור. הסר בזהירות את דאפי עודף-פתרון על ידי בעדינות לחיצה על השקופית בין ניירות סינון. לאחסן את השקופיות ב 2-8 ° C בחושך עד 2 שבועות עד הערכה על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. 6. קונאפוקלית הדמיה וסריקה של דגים שקופיות לבצע הדמיה וסריקה קונאפוקלית של השקופיות על קונפוקלי סורק דיגיטלי מצויד עם 40 x / 1.2 המטרה נה, סגיב (דאפי/FITC/TRITC/Cy5) ומסננים של 5.5Mpx, של 16 סיביות, מקורר מדעי משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (CMOS) המצלמה. לרכוש את התמונות עם מסננים עבור ירוק (עירור: 503 ננומטר, פליטה: 528 ננומטר) וכתום (עירור: 547 ננומטר, פליטה: 572 nm) ערוצים. 7. פרשנות הערה: החללית HER2/CEN17 הוא תערובת של אדום מתויג fluorochrome CEN17 בדיקה ספציפית עבור האזור centromeric לוויין אלפא של כרומוזום 17 (D17Z1) הירוק מתויג fluorochrome HER2 בדיקה ספציפית עבור הגן HER2 (בדיקה מיקום 17q12). דגימות הגידול עם ≤2.0 יחס HER2:CEN17 לכל גרעין בשיירה כרגיל, בעוד אלה עם ≥2.0 יחס HER2:CEN17 הם הבקיע כמו מוגבר17. לבצע ניתוח איכות של התמונות עם מקור פתוח CaseViewer 2.120. הערכת לפחות 20 תאים ממוקמים בשני אזורים שונים של הרכיב פולשנית של קרצינומה כפי שהוגדרו על ידי פתולוג. כוללים ניתן להבחנה ברורה גרעינים מבוזר היטב באזור הספירה. אל תכלול ספירת רקמות אזורי גבול, אזורים שקועה או סחוט. 8. RNA איכות החילוץ-RNA להבטיח כי כל מכשירים וכלים RNAse חינם. השתמש RNAse-הסרת פתרון. חותכים בסעיפים 10 עד 20 (בעובי 5 מיקרומטר) של דגימות NCFPE או FFPE באמצעות של מיקרוטום בעקבות הפרוטוקול עד שלב 3.8. לחלץ RNA NCFPE דוגמאות שימוש הבידוד RNA קיט (ראה טבלה של החומרים). תמצית ה-RNA מדגימות FFPE באמצעות ערכת בידוד FFPE RNA.הערה: מן-קישור בין כתות ומייצבים החילוץ של RNA מחייבת בשיטת בידוד המותאמים בשיטת קיבוע. אין להשתמש בשום RNA בידוד שיטה אחרת (למשל Trizol, RNeasy FFPE, וכו ‘ עבור הדגימה NCFPE). לקבוע את ריכוז ה-RNA וטוהר באמצעות ספקטרופוטומטרים. היחס בין ספיגת ב-260 nm ו 280 ננומטר (A260/280) צריך להיות ~ 2.0. לאחסן את הרנ א מבודדים ב-70 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף. ביצוע של גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) בזמן אמת שעתוק במהופך PCR באמצעות תחל לייצר amplicons באורכים שונים8,9. להשתמש ערכת שעתוק במהופך cDNA בהתאם להוראות manufacturer´s cDNA סינתזה. השתמש RNA 500 ננוגרם של כל דגימה. לאחסן cDNA ב-20 ° C עד שימוש נוסף. מכינים את תערובת הבסיס PCR בהתאם להוראות manufacturer´s. Pipette המיקס מאסטר PCR ב triplicates בצלחת תגובה 384-. טוב. להוסיף 4 µL 1:16 מדולל cDNA (PCR תבנית). לבצע את ה-PCR בהתאם להוראות manufacturer´s.הערה: עבור GAPDH האנושי, תחל הבאים שימשו: GAPDH קדימה: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH הפוכה: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ ו- 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´. לנתח את התוצאות באמצעות תוכנה החלות על המכונה PCR. מוצרים לא ספציפית לא ייכללו בהתבסס על ההיתוך עקומת ניתוח21.

Representative Results

דגים HER2 נחישות: עוצמות האות HER2-דג FFPE ו NCFPE הם דומים (איור 2). בשני המקרים, רוב התאים הצג של עודף ברורה של אות ירוק (מצביע על מיקומה ג’ין HER2 מוגבר) לעומת האות האדום (CEN17 התייחסות ג’ין). לכן, המקרה מראה של ג’ין HER2 מוגבר, מה שאומר כי החולה הזה צפוי להגיב על הרצפטין, טיפול אנטי-HER2 ממוקד. הדגימה FFPE שימש בקרה חיובית. האותות נצפו תאים ללא אמצעים (הן FFPE והן NCFPE) לשמש להפניה פנימית ובקרה שלילי עבור HER2 ג’ין הגברה. עבור כל סדרת ניתוח, לפחות מקטע אחד עם הגברה הגן ידוע מצב צריך לשמש בקרה חיובית עבור התגובה הכלאה. איכות ה-RNA: FFPE המתאימים, NCFPE דגימות בשני תיקים שונים מראים הבדלים באיכות RNA בהחלת שעתוק במהופך בזמן אמת PCR. התוצאות המתקבלות הראה יעילות הגברה שונה עבור אורכי אמפליקון שונים (קרי, 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) של ה-mRNA GAPDH. כל הערכים Ct (מחזור מפתן) המתקבל דגימות FFPE היו גבוהות מאלו של NCFPE. הבדל זה מדגים את amplificability ה-PCR התחתון של mRNA מבודד FFPE רקמות, מציעה שינוי כימי מובהק יותר. יתר על כן, הערכים Ct גבוה יותר לעומת זמן קצר amplicons הן אינדיקטור mRNA שאין בהם פיצול. לשם השוואה, מדרונות ערך Ct האורכים אמפליקון שונים מראה יותר מבטאים את הפיצול mRNA FFPE מאשר NCFPE ברקמות (איור 3). איור 2: תוצאות נציג של HER2 דגים פורמלין המתאימים קבוע פרפין מוטבע (FFPE) ומוטבעים פרפין קבוע-קישור קרוס, ללא פורמלין מקטעים רקמות (NCFPE). דוגמאות המתאימות מן הרקמות FFPE (א) ו- NCFPE (ב) לאותו מוצגים. בניגוד לאטמוספרה נורמלי תאים (ג), שבו שני ירוק (HER2) ו שני אותות (CEN17) אדום צפויים, תאים עם לוקוס ג’ין HER2 מוגבר מייצגים עותקים מרובים של אותות ירוק (HER2) (D). HER2 הגברה המצב היה זהה, הן FFPE והן הסעיפים NCFPE פוסט-קבועה (A, B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: תוצאות assay PCR שעתוק במהופך בזמן אמת המשמש לבקרת איכות רנ א. ציר y: Ct (מחזור מפתן) ערכים של הגן GAPDH מוצגים עבור אורכים שונים אמפליקון (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) בציר ה-x. mRNA הופרדה מרשת FFPE ו- NCFPE של שתי שדיים שונים סרטן דגימות רקמה עיבוד מקבילי, משועתקים ל cDNA עבור ה-PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

התוצאות מדגימים שני הממצאים העיקריים. ראשית, צעד קיבוע שאחרי פשוט 24 שעות SBFS של מקטעים של רקמות NCFPE מספיקה להשיג תוצאות שוות ערך לאלה עם FFPE דגים בניתוח באמצעות מבחני דג מאושר בשביל לרקמות FFPE (ראה גם אסמכתא¹⁴). פרוטוקול זה יש את היתרון של שימוש מבחני דגים במקור פותח ואושרו על FFPE ללא צורך revalidation מקיף (למשל, על-ידי מיטוב תנאי קדם הכלאה רקמה שאינם מקושרים הצלב). ניתן להשתמש בפרוטוקול דגים בדיוק כפי שמתואר בהוראות היצרן.

שינויים מזעריים מן ההוראות manufacturer´s המתוארות פרוטוקול (למשל רקמות סעיף קוטר הדגירה ותקופות על המדרגות deparaffinization) תוצאה זו של עיבודים הקודם, אשר מומלץ במפורש על ידי היצרן עקב השימוש של רקמות שונות סוגים ושיטות קיבעון.

השלב קיבוע שאחרי הוא קריטי כי זה דורש זמן תגובה כימית של 18-24 h, אשר מרחיב את הזמן ניתוח ביום אחד אלא מאפשר אותה זרימת עבודה יומי כפי שפותחו עבור FFPE רקמות (איור 1). SBFS הוא דיווח לחדור רקמות בשיעור ממוצע של 1 מ מ לכל שעה²² ל 5 מ מ ב- 2 h בהתאם סוג הרקמה²³^,²⁴. התצפית כי רק קיבוע שאחרי תקופות ממושכות של יותר מ 18 h לשנות את המאפיינים של NCFPE FFPE מקטעים, מציין כי לא החדירה של מקבע את אבל את זמן התגובה הכימית היא קריטית להשגת התוצאות הרצויות¹ ^,¹⁴.

שנית, הרקמה NCFPE הנותרים שלא משמש עבור קיבוע שאחרי יכול לשמש בהמשך המולקולרי ניתוחים כמו מולקולות השתמרה היטב. זה הודגם על ידי שעתוק במהופך בזמן אמת PCR (איור 3). וזמינותו הוא רגיש יותר ספציפי מהערך נגזר electropherogram רין (RNA תקינות מספר) ביחס איכות RNA (דהיינו, שינוי כימי, פיצול) עבור ה-mRNA מבודד מן הרקמות פרפין-מוטבע⁸. בקרת איכות הוגבלה במחקר זה ל- PCR בזמן אמת מאז קבוצות עצמאיים הראו כי בנוסף RNA, האיכות של ה-DNA, חלבונים מבודד NCFPE הוא טוב יותר FFPE רקמות ⁸^,⁹^, ¹³.

את הפרוטוקול שהוצג כדלקמן, ובמידת הצורך (למשל, מתכון SBFS, קיבוע תנאים, בקרת איכות RNA, אימות), לדרישות המפרט הטכני CEN עבור תהליכים אנליטיים מראש עבור הפריה אבחון (מהיר), אשר לאחרונה פורסמו על ידי הוועדה האירופית תקינה (CEN) (למשל CEN/TS 16827-1:2015 לבידוד-RNA רקמות FFPE המתייחס בתקן ISO 15189).

השיטה זו מוגבל לשבועיים הספציפי הזה. למרות שמירה טובה על מולקולות ו מורפולוגיה באמצעות מקבע את הלא-קרוס-קישור, ללא פורמלין הוצגו במספר מחקרים, הוא משמש בעיקר במחקר אך לא שגרתית יישומים רפואיים. סיבה אחת היא כי החלפת תקן הזהב SBFS קיבעון על ידי מקבע אחר ידרוש מגוון רחב של לימודי אימות כפי לא כל הפרוטוקולים אופטימיזציה עבור החומר FFPE יכול לשמש עבור חומרים קבוע עם כתות ומייצבים הלא-קרוס-קישור. שיטות קיבוע רקמות אחרות לא נבדקו עבור פרוטוקול זה דג.

שלב קיבוע שאחרי פשוט תיאר כתב יד זה יש את היתרון של שימוש מהיר אישר מבחני שני בשביל לרקמות FFPE ו- NCFPE.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לצוות של המעבדה פתולוגיה מולקולרית במכון של פתולוגיה של הרפואה אוניברסיטת גראץ (graz) עבור המומחיות שלהם ותמיכה. יתר על כן, אנו מודים איריס Kufferath, דניאלה פבסט לקבלת סיוע טכני, ברנדט ריגר, סילביה Eidenhammer לעיבוד המקרים HER2 וכן קינגה Szurian (פתולוגית), Tamas Regényi (3DHISTEC). אנו מודים פנלופה Kungl להגהת כתב היד. עבודה זו היא כלכלית נתמכה על ידי קרן מחקר כריסטיאן דופלר, משרד הפדרלית האוסטרית המדע, המחקר ואת הכלכלה הקרן הלאומית למחקר, טכנולוגיה ופיתוח.

Materials

SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany	www.sav-lp.de	FN-200L-4-1	Tissue fixative
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada	www.simport.com	M-498	Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765112	For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	813150	Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
Merck Millipore, Munich, Germany	www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html	MC1009834000	Dehydration of tissue samples
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany	https://at.vwr.com	10293EP	Dehydration of tissue samples
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria	www.herba-chemosan.at	2549662 32	Paraffin used in a tissue processing device
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria	www.LeicaBiosystems.com	39602004	Paraffin embedding medium
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria	www.sanova.at	5229	Paraffin embedding instrument for tissues for histology
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria	www.histocom.info	M 910010	This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark	www.chem.agilent.com	K802021-2	Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	73504	For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765134	For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany	www.zytovision.com	Z-2015-200	For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
3DHISTEC, Budapest, Hungary	www.3dhistech.com		Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4368814	The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4367659	PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE	www.thermofisher.com	Ser. Nr. F239	Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System	www.thermofisher.com	4485701	PCR machine,
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A	www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order	e.g. (ThermoBrite) 07J91-020	Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

References

Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O’Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714 (2013).
Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704 (2011).
Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
Applied Biosystems. . QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , (2013).
NCCLS. . Quality Assurance for Immunocytochemistry. , (1999).
Baker, J. R. . Principles of Biological Microtechnique. , (1958).
Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

Automatically Generated