Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Martina Loibner; Lisa Oberauner-Wappis; Christian Viertler; Daniel Groelz; Kurt Zatloukal

doi:10.3791/55885

JoVE Journal > Cancer Research

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Cancer Research

Protokoll für HER2 Fischen mit nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe Fixiermittel, Vorteile der Kryokonservierung und Formalin Fixierung zu kombinieren

Published: December 25, 2017

doi:

10.3791/55885

Martina Loibner^1,2, Lisa Oberauner-Wappis^1,2, Christian Viertler², Daniel Groelz³, Kurt Zatloukal^1,2

¹Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology,Medical University Graz, ²Institute of Pathology,Medical University Graz, ³Research and Development,Qiagen GmbH

Summary

Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) wird häufig in Kombination mit Histopathologie und molekulare Diagnostik für die Auswahl der Therapie in der personalisierten Medizin benötigt. Eine neuartige nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe Fixiermittel, mit dem hochwertigen morphologische, molekulare und Fisch Analysen aus der gleichen Probe durch Zugabe von einem Post-Fixierung Schritt bevor Fisch dargestellt wird.

Abstract

Morphologische Beurteilung von Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben ist seit Jahrzehnten durch seine ausgezeichnete Erhaltungszustand der Morphologie der Goldstandard für die Krebsdiagnostik. Personalisierter Medizin bietet zunehmend individuell angepasste und gezielte Therapien für zeichnet sich einzelne Krankheiten, die durch kombinierte morphologische und molekulare analytische Technologien und Diagnostik ermöglicht. Leistung der morphologischen und molekularen Tests aus der gleichen FFPE-Probe ist schwierig wegen der negativen Auswirkungen von Formalin durch chemische Modifikation und Vernetzung von Nukleinsäuren und Proteine. Ein nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe Fixiermittel wurde vor kurzem entwickelt, d. h. beide Voraussetzungen zu erfüllen, Morphologie wie Proteinkinase und Biomoleküle wie Kryokonservierung zu bewahren. Da Fische oft in Kombination mit Histopathologie und molekulare Diagnostik erforderlich ist, testeten wir die Anwendbarkeit des Fisch-Protokolle auf Gewebe, die mit dieser neuen Fixativ behandelt. Wir fanden, dass Formalin Post-Fixierung der histologischen Abschnitte von nicht-Cross-linking, Formalin-frei und Paraffin-eingebetteten (NCFPE) Brust Krebs Gewebe erzeugt gleichwertige Ergebnisse mit FFPE Gewebe im menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) FISH-Analyse. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Fisch-Assay, ursprünglich entwickelt und validiert für FFPE Gewebe durch einen einfachen Post-Fixierung Schritt der histologischen Abschnitte für NCFPE Gewebe verwendet werden kann.

Introduction

Personalisierter Medizin setzt zunehmend auf Multiparameter-Tests mit morphologischen und molekularen Gewebe Analysen. Formalin Fixierung des Gewebes als Goldstandard bietet ausgezeichnete morphologische Qualität¹^,². Molekulare Analyse⁶stört jedoch Formalin-induzierte chemische Modifikation und Vernetzung von Proteinen und Nukleinsäuren³^,⁴^,⁵ negativ. Diese molekularen Änderungen die Qualität von Nukleinsäuren und Proteinen zu begrenzen und gen-Sequenz Artefakte⁷ oder verringerte Empfindlichkeit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Umständen-basierte Assays⁸. Obwohl große Anstrengungen unternommen wurden, um molekulare Tests für FFPE Gewebe zu optimieren, ist Kryokonservierung von Gewebe in Generaloberin, Formalin Fixierung, machen es notwendig, Gewebeproben für verschiedene Erhaltung Verfahren aufgeteilt. Zur Vermeidung der Notwendigkeit einer Kryokonservierung für molekulare Analysen, eine nicht-Cross-linking, entwickelte Formalin-freie Fixativ PAXgene Gewebe. Diese im Handel erhältliche System besteht aus einer Fixierung und einer Stabilisierung-Lösung mit verschiedenen Alkoholen, Essigsäure und eine lösliche organische Verbindung. Pflege und Bewahrung von Nukleinsäuren, Proteine (Phospo) und Morphologie wurde in mehreren Studien⁶^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³gezeigt.

Eine besondere Anwendung in der Krebs-Diagnose ist Fisch erkennen eine umfassende Palette von chromosomalen Veränderungen, wie z. B. Translokationen, submikroskopische Deletionen und Vergrößerungen ¹⁴. Zwanzig Prozent der invasiven Brustkrebstumoren zeigen beispielsweise Verstärkung des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) gen¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, die im Zusammenhang mit einer schlechten Prognose¹⁸ ^,¹⁹. Bestimmung des HER2-Überexpression und Verstärkung Status bei Brustkrebs von Fischen ist erforderlich, um Patienten für Anti-HER2-gerichtete Therapie auswählen und ist ein Begleiter diagnostische aufgeführt von der Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)¹⁷. Um eine breite Anwendung der Fisch basierende Begleiter Diagnostik in der Gesundheitsversorgung zu ermöglichen, wurden Tests entwickelt und zugelassen für FFPE Gewebe.

In einer früheren Studie zeigten wir, dass NCFPE Gewebe für Fisch-Assays verwendet werden können, die für FFPE Gewebe genehmigt worden sind. Prüfungen der Reihe von anderen Dienstposten Fixierung Verfahren von NCFPE Gewebe mit 4 %, gepuffert Formaldehyd hat gezeigt, dass Fixierung Zeiten von 18 h oder länger von NCFPE Gewebeschnitte buchen erreichte aber gleichwertige Ergebnisse mit FFPE Gewebe¹⁴.

In dieser Studie wir bieten ein detailliertes Protokoll und zeigen, dass die Auswirkungen von nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe Fixierung und 24 h 4 % Formaldehyd Post-Fixierung auf Abschnitten verwendet für die HER2-Fisch und RNA aus der gleichen primären Gewebeprobe gepuffert.

Abbildung 1: das Diagramm zeigt die Schritte zur Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) und RNA Analyse von Formalin fixiert Paraffin eingebettet (FFPE) und nicht-Cross-linking, Formalin-freie feste Paraffin eingebetteten Gewebe (NCFPE). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

Die Studie wurde von der Ethikkommission der medizinischen Universität Graz (Referenz Nummer 20-066), genehmigt Österreich. Gewebeproben wurden von zwei Fällen chirurgisch reseziertem primäre invasive Mammakarzinome erhalten, nachdem die Patienten schriftliche Einwilligung gegeben hatte. (1) Gewebe Fixierung Hinweis: Gewebe Fixierung ist durchgeführt, entweder mit standard gepuffertem Formalin-Lösung (SBFS), definiert als 10 % Formalin-Lösung mit einem Massenanteil von 3,7 % (entspricht einem Volumenanteil von 4 %) Formaldehyd gepuffert, pH 6,8 und pH 7,2 nach CEN/TS 16827-1:2015 oder das nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe-Befestigungssystem (auch bezeichnet als die Alternative Befestigung Lösung unten) bestehend aus einem Fixiermittel und einem Stabilisator-Lösung bei Raumtemperatur (RT). Schneiden Sie die Brust Krebs Gewebeproben mit einem sterilen Skalpell in zwei Hälften jedes 4 mm dick sein, um ausreichend Gewebe Menge zu gewährleisten. Verwenden Sie eine maximale Größe von 4 x 15 x 15 mm, für NCFPE oder SBFS Gewebe Fixierung. Legen Sie jeweils die Hälfte der Tumor-Probe in einer standard-Gewebe-Kassette und Tauchen Sie es in SBFS oder die alternative Befestigung Lösung für 24 h mit einem Volumen pro Volumen-Verhältnis (V/V) 4 Teile Fixiermittel und einerseits Gewebe (Gewebe (idealerweise 10 mL/1 g), 4 mL/1 g). Übertragen Sie die alternativ fixiert Proben durch Öffnen des Containers, die Gewebe-Kassette um 180° drehen und eintauchen in die Stabilisator-Lösung für 2-72 h. Legen Sie die Gewebe-Kassetten mit den SBFS-feste Proben in 250 mL 70 % igem Ethanol für 30 min bei RT, passives SBFS zu entfernen.Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig zur Vermeidung von SBFS Kontaminationen von nicht-Cross-linking Fixativ behandelt Proben in der automatisierten Gewebe-Prozessor, was die positiven Eigenschaften von nicht-Cross-linking Fixiermittel für Erhaltung der Biomoleküle zerstören würde.Achtung: SBFS ist eine gefährliche Lösung, verursacht Hautreizungen, schwere Augenschäden, kann dazu führen, dass eine allergische Hautreaktion, wird verdächtigt, genetische Defekte verursachen, verursachen Krebs, Reizung der Atemwege, Schläfrigkeit und verursacht Schäden an Organen. Das alternative Fixiermittel ist giftig beim Einatmen, Berührung mit der Haut und Verschlucken reizt die Augen und die Haut, Gefahr, sehr ernste irreversible Auswirkungen durch Einatmen, Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Einatmen und Körperkontakt sollte für beide Fixierung Lösungen vermieden werden. Tragen Sie geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen-und Gesichtsschutz. Arbeiten Sie in einer Dampfhaube. Fahren Sie mit Gewebe Verarbeitung, einbetten und Gewebe schneiden (Abschnitte 2 und 3). (2) Gewebe Verarbeitung und Einbettung Führen Sie schrittweise Entwässerung des Gewebes Kassetten mit den festen Gewebeproben in 70 % (2 x 15 min), 80 % (30 min), 90 % (60 min) und 99 % (2 x 60 min) Ethanol, gefolgt von Xylol (2 x 60 min). Dann infiltrieren Sie mit Paraffin in einen automatisierten Gewebe-Prozessor (4 x 45 min.). Mit Zange, legen Sie die dehydrierten und Paraffin infiltriert Proben (Alternativ und SBFS-feste) in Metallformen. Einbetten der Proben in 5-10 mL flüssigem Paraffin (Erstarrung Punkt 56-58 ° C) mit einer Paraffin-Einbettung instrument. Legen Sie die Formen auf einer Kühlplatte bei-5 ° C für 30 Minuten. Die Paraffin-eingebetteten Gewebe Blöcke aus den Formen zu erholen. Die resultierenden Blöcke (alternativ-fixiert, Paraffin-eingebetteten (NCFPE) und SBFS fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE)) im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung. (3) Gewebe schneiden und Folie Vorbereitung für Fische Hinweis: Proteinkinase Abschnitte sind direkt für Fische, verwendet, während Folien mit NCFPE Abschnitte im SBFS für 24 h vor Fisch Eingriff nach behoben werden. Legen Sie eine Einweg-Klinge in das Mikrotom und passen Sie das Mikrotom bis 10 µm. Nehmen Sie den ersten Block von der Kühlplatte und stecken Sie es in das Instrument. Schneiden Sie den Block, bis eine gleichmäßige Oberfläche erzielt wird. Reinigen Sie das Mikrotom mit einer Bürste zu und passen sie an 3 µm. verwerfen der ersten 2-3 Abschnitte. Schneiden Sie 3 µm Abschnitte NCFPE und FFPE Blöcke und legen Sie sie in ein kaltes Wasserbad (Reinstwasser).Hinweis: Um bessere Fotos ohne überlappende Kerne zu erhalten, sind hier Bilder von 2 µm Abschnitte anstelle von 3-5 µm wie in den Anweisungen des Herstellers empfohlen gezeigt. Jeder schwimmende Abschnitt mit einem feinen Pinsel und eine Nadel auf beschichteten Objektträger für die Haftung der Gewebeschnitte abholen. Diese Folie in eine warme (40 ° C) stürzen Wasserbad und lassen Sie den Abschnitt vollständig Strecken. Setzen Sie im Abschnitt wieder auf der Folie durch vorsichtig abziehen der Folie aus dem Wasser und vermeiden Sie Falten. Lassen Sie alle Abschnitte, die bei Raumtemperatur 1 Stunde trocknen. Erhitzen Sie die Folien bei 70 ° C für 30 min in einem Inkubator das Paraffin schmilzt. Legen Sie die Folien horizontal in einem Glas Glas Färbung. Rehydrieren die Abschnitte schrittweise bei RT in den Färbeküvetten mit 250 mL der folgenden Flüssigkeiten gefüllt: 100 % Xylol 2 x 15 min, 96 % Ethanol 2 x 15 min, 90 % Ethanol, 2 min, 80 % Ethanol, 2 min, 70 % Ethanol, 2 min, 50 % Ethanol 2 min , und destilliertem Wasser 2 x 10 min..Achtung: Führen Sie 4.wenn und Rehydrierung Schritte in einer Dampfhaube, nicht atmen Sie giftiger Lösungsmittel verflüchtigt ein.Hinweis: Je nach Abschnitten und Gewebe, kann es unterschiedliche Inkubationszeiten vorab testen erforderlich. 4. Post-Fixierung der NCFPE Exemplare Durchführen Sie Post-Fixierung von NCFPE Folien, indem man sie in eine neue Färbung Glas, gefüllt mit SBFS 24 h bei RT. Stelle das Gefäß in einer Dampfhaube während 24 h Post-Fixierung Schritt. Entfernen Sie überschüssiges SBFS durch Waschen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (3 x 10 min) und destilliertes Wasser (2 x 10 min). (5) Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Hinweis: Hier Angeln erfolgt über die im Handel erhältlichen HER2/CEN17 dual Color Sonde Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie sich nicht die Gewebeschnitte während der Hybridisierung und Waschschritte trocknen. Lassen Sie nicht die DNA-Sonde und 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) DNA Gegenfärbung Lösungen für längere Zeit dem Licht ausgesetzt werden. Führen Sie diese Schritte in der Dunkelheit mit lichtdichten Behälter. Je nach dem Alter und der Fixierung Schritt des Probenmaterials erhöhen Sie oder verringern Sie die Denaturierung und waschen Sie Temperaturen besser Hybridisierung Ergebnisse zu erzielen. Legen Sie eine Färbung JAR-Datei mit 250 mL Hitze Vorbehandlung Lösung Zitronensäure im Wasserbad 98 ° C. Eingeweichtes Proteinkinase und Post-feste NCFPE gleitet in das Glas und 15 min inkubieren.Verwenden Sie nicht mehr als sechs Folien pro Glas Färbung. Waschen Sie die Folien in destilliertem Wasser für 3 min bei RT in eine neue Färbung Glas. Platz für Proteolyse Dias in einem temperaturgeregelten Hybridisierung System bei 37 ° C. Sofort, gelten die Ready-to-Use Pepsin Lösung (2mg/ml) tropfenweise (~ 30 µl pro Tropfen), die Gewebeschnitte bis es vollständig bedeckt ist. 9 min bei 37 ° C in der Hybridisierung System inkubieren.Hinweis: Eine Inkubationszeit von 5-15 Minuten wird empfohlen. Der optimale Zeitpunkt für Proteolyse sollten im Voraus ermittelt werden. Legen Sie die Folien in einer JAR-Datei mit Waschpuffer SSC und 5 min inkubieren. Spülen Sie die Folien in destilliertem Wasser für 1 min bei RT Austrocknung der Abschnitte in der folgenden abgestuften Alkohole durchführen: 50 %, 70 %, 90 % und 100 % für 1 min. Luft trocknen die Abschnitte. Für die Hybridisierung, Pipette 10 µL HER2/CEN17 Sonde auf die getrockneten Gewebeschnitte jede Probe mit einem Deckglas abdecken und mit Gummilösung abdichten.Hinweis: 10 µL der Sonde wird pro 22 x 22 mm-Gewebe-Bereich empfohlen. Eine sanfte Erwärmung der Sonde erleichtert den Pipettieren Prozess. Vermeiden Sie Luftblasen und Langzeitbelichtung der Sonde an das Licht. Co denaturieren Sie Sonde und Probe DNA in der Hybridisierung-System bei 75 ° C für 10 Minuten. Die Hybridisierung System auf 37 ° C und hybridisieren über Nacht. Entfernen Sie vorsichtig die Gummilösung mit der Pinzette für die Post-Hybridisierung und Detektion. Inkubieren Sie den Folien in einer Färbung Glas mit 37 ° C vorgewärmt 1 X Waschpuffer A für 5 min. entfernen die Deckgläsern. Waschen der Folien mit vorgewärmt 1 X waschen Puffer A zweimal für 5 min bei 37 ° C. Folien in 70 %, 90 % und 100 % Ethanol, 1 min zu entwässern. Die Proben in Luft trocken und vor Licht schützen. Beantragen Sie beflecken, 30 µL DAPI-Lösung zum Bereich hybridisierten Luftblasen zu vermeiden. Die Abschnitte mit einem Deckgläschen abdecken. Inkubieren Sie 15 min vor Licht geschützt werden. Entfernen Sie überschüssige DAPI-Lösung vorsichtig durch leichtes Drücken der Folie zwischen Filterpapiere. Speichern Sie die Folien bei 2 bis 8 ° C im Dunkeln für bis zu 2 Wochen bis Auswertung von konfokalen Mikroskopie. 6. Confocal Imaging und Scannen von Dias Fisch Führen Sie confocal imaging und Scannen von Dias auf einem konfokalen digitale Scanner ausgestattet mit einem 40 X / 1,2 NA Objektiv, Quad-Band-Filter (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) und eine 5.5Mpx, 16 Bit, gekühlt wissenschaftliche komplementäre Metalloxid-Halbleiter (CMOS) Kamera. Erwerben Sie die Bilder mit Filter für Grün (Anregung: 503 nm, Emission: 528 nm) und Orange (Anregung: 547 nm, Emission: 572 nm) Kanäle. 7. interpretation Hinweis: Die HER2/CEN17-Sonde ist eine Mischung aus einer roten Fluorochrom-markierte CEN17 Sonde bestimmte für die alpha Satelliten Zentromer-Region von Chromosom 17 (D17Z1) und eine grüne Fluorochrom-markierte HER2 Sonde bestimmte für das HER2-gen (Sonde Standort 17q12). Tumor Proben mit einem HER2:CEN17 Verhältnis ≤2.0 pro Kern werden als normal gewertet, während diejenigen mit einem HER2:CEN17 Verhältnis ≥2.0 als verstärkte17erzielt werden. Führen Sie Qualitätsanalyse der Bilder mit der open-Source CaseViewer 2.120. Bewerten Sie mindestens 20 Zellen, die in zwei verschiedenen Regionen der invasiven Komponente eines Leberzellkarzinoms definiert durch einen Pathologen befinden. Sind deutlich unterscheidbar gut verteilte Zellkerne im Bereich zählen. Von der Zählung Gewebe Regionen an der Grenze und eingefahren oder gepressten Bereiche ausschließen. (8) RNS-Qualität RNA-Extraktion Sicherstellen Sie, dass alle Instrumente und Werkzeuge RNAse frei sind. Verwenden Sie eine RNAse-entfernen Lösung. 10 bis 20 Zuschnitte (5 µm dick) NCFPE oder Proteinkinase Proben mit ein Mikrotom nach das Protokoll bis zum Schritt 3,8. NCFPE RNA extrahieren Proben mit der RNA-Isolation kit (siehe die Tabelle Materialien). Extrahieren Sie RNA aus FFPE-Proben mit einer FFPE RNA Isolierungskit.Hinweis: Gewinnung von RNA aus nicht-Cross-linking Fixiermittel erfordert eine Isolationsmethode angepasst an die Befestigungsmethode. Verwenden Sie keine andere RNA Isolierung Methode (z. B. Trizol, RNeasy FFPE, etc. für NCFPE-Probe). Die RNA-Konzentration und Reinheit mit einem Spektralphotometer zu bestimmen. Das Verhältnis der Absorption bei 260 nm und 280 nm (A260/280) sollte sein ~ 2.0. Speichern der isolierten RNS bei-70 ° C bis zur weiteren Analyse. Führen Sie eine Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) in Echtzeit reversen Transkription PCR mit Primer Amplifikate von unterschiedlicher Länge8,9erzeugen. Verwenden Sie eine cDNA reversen Transkription Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers für die cDNA-Synthese. Verwenden Sie 500 ng RNA jeder Probe. CDNA bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern. Bereiten Sie die PCR-master-Mix gemäß den Anweisungen des Herstellers. Pipette die PCR-master-Mix in Triplicates in einer Reaktion 384-Well-Platte. Fügen Sie 4 µL 01:16 verdünnt cDNA (PCR-Vorlage). Führen Sie die PCR gemäß den Anweisungen des Herstellers.Hinweis: Für menschliche GAPDH, wurden die folgenden Primer verwendet: GAPDH nach vorne: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH Rückseite: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ und 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´. Analysieren Sie die Ergebnisse mit Hilfe einer Software für die PCR-Maschine. Unspezifische Produkte müssen anhand der schmelzenden Kurve Analyse21ausgeschlossen werden.

Representative Results

Fisch-HER2-Bestimmung: Die HER2-Fisch Signalintensitäten aus FFPE und NCFPE sind ähnlich (Abbildung 2). Beide Fälle in den meisten Zellen zeigen eine klare Überschuss an das grüne Signal (indikativ für die verstärkte HER2-gen-Locus) im Vergleich zu das rote Signal (CEN17 Referenz-gen). Der Fall zeigt daher eine verstärkte HER2-gen, das bedeutet, dass dieser Patient auf Trastuzumab, eine Anti-HER2 voraussichtlich wird-gezielte Therapie zu reagieren. Die Proteinkinase Probe diente als positive Kontrolle. Die Signale beobachtet in nicht-neoplastischen Zellen (sowohl in Proteinkinase und NCFPE) dienen als interne Referenz und Negativkontrolle für HER2-gen-Amplifikation. Für jede Analyse-Serie sollte mindestens einen Abschnitt mit bekannten gen-Amplifikation Status als Positivkontrolle für die Hybridisierungsreaktion verwendet werden. RNS-Qualität: Entsprechenden Proteinkinase und NCFPE Proben von zwei verschiedene Fälle zeigen Unterschiede in der RNS-Qualität durch den Einsatz von Echtzeit-reverse Transkription PCR. Ergebnisse zeigen unterschiedliche Verstärkung Wirkungsgrade bei verschiedenen Amplikons Längen (d. h. 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) der mRNA GAPDH. Alle Ct (Zyklus Schwelle) Werte aus FFPE-Proben waren höher als die von NCFPE. Dieser Unterschied zeigt die untere PCR-Amplificability der mRNA isoliert aus FFPE Gewebe, was auf eine stärkere chemische Modifikation. Darüber hinaus sind die höheren Ct-Werte für lange im Vergleich zu kurzen Amplifikate Indikator für mRNA Fragmentierung. Im Vergleich dazu die Ct Wert hängen von verschiedenen Amplikons Längen zeigt deutlicher mRNA Fragmentierung in FFPE als NCFPE Gewebe (Abbildung 3). Abbildung 2: repräsentative Ergebnisse von HER2 Fisch für entsprechende Formalin fixiert Paraffin eingebettet (FFPE) und nicht-Cross-linking, Formalin-freie feste Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten (NCFPE). Entsprechenden Proben aus dem gleichen Gewebe Proteinkinase (A) und NCFPE (B) werden angezeigt. Im Gegensatz zu normalen Interphase Zellen (C), wo zwei grüne (HER2) und zwei rote (CEN17) Signale erwartet, Zellen mit verstärkten HER2-gen-Locus repräsentieren mehrere Kopien der grüne Signale (HER2) (D). HER2-Amplifikation-Status war identisch in Proteinkinase und die Post-feste NCFPE Abschnitte (A, B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Ergebnisse eines Echtzeit-reverse Transkription PCR-Assays für RNA Qualitätskontrolle verwendet. Y-Achse: Ct (Zyklus Schwelle) Werte des Gens GAPDH werden für unterschiedliche Amplifikate Längen angezeigt (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) auf der X-Achse. mRNA wurde isoliert aus FFPE und NCFPE von zwei verschiedenen Brust Krebs Gewebeproben in parallel und transkribierten, cDNA für PCR verarbeitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die Ergebnisse zeigen zwei wichtige Erkenntnisse. Erstens ist ein einfache 24 h SBFS Post-Fixierung Schritt Abschnitte geschnitten aus NCFPE Gewebe ausreichend zu gleichwertigen Ergebnissen mit Proteinkinase in Fisch Analysen mit Fisch-Assays für FFPE Gewebe zugelassen (siehe auch Hinweis¹⁴). Dieses Protokoll hat den Vorteil der Verwendung von Fisch-Assays ursprünglich entwickelt und zugelassen für Proteinkinase ohne die Notwendigkeit einer umfassenden Revalidierung (z. B. durch Optimierung der Pre-Hybridisierung Bedingungen für nicht-Cross-linked Gewebe). Die Fisch-Protokoll kann genau wie beschrieben in den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.

Geringfügige Änderungen von den letztgültigen Anweisungen in diesem Protokoll (z. B. Gewebe Abschnitt Durchmesser und Inkubation Perioden 4.wenn di Spagna) Ergebnis aus vorherigen Bearbeitungen, die ausdrücklich vom Hersteller empfohlen wird durch den Einsatz von verschiedenen Gewebetypen und Fixierung Methoden.

Der Post-Fixierung Schritt ist entscheidend, da es eine chemische Reaktion Zeit von 18-24 h,, die die Analysezeit um einen Tag verlängert, sondern ermöglicht den gleichen täglichen Workflow erfordert wie für FFPE Gewebe (Abbildung 1) entwickelt. SBFS wird berichtet, dass Gewebe mit einer durchschnittlichen Rate von 1 mm pro Stunde²² , 5 mm in 2 h, je nach Gewebe Typ²³^,²⁴eindringen. Die Beobachtung, dass nur Post-Fixierung längere mehr als 18 h FFPE-Abschnitte, die Eigenschaften des NCFPE ändern könnte weist darauf hin, dass nicht das Eindringen von das Fixiermittel, aber die chemische Reaktion Zeit entscheidend für die Erreichung der angestrebten¹ ^,¹⁴.

Zweitens kann das restliche NCFPE Gewebe, das nicht für Post-Fixierung dient für weitere molekulare Analysen verwendet werden, wie die Biomoleküle gut erhalten sind. Dies zeigte sich durch Echtzeit-reverse Transkription PCR (Abbildung 3). Der Test ist empfindlicher und spezifischer als die Electropherogram abgeleitet RIN Wert (RNA-Integrität-Nummer) im Hinblick auf RNS-Qualität (z. B. chemische Modifikation und Fragmentierung) für die mRNA isoliert von Paraffin-eingebetteten Gewebe⁸. Qualitätskontrolle war in dieser Studie auf Real-Time PCR beschränkt, da unabhängige Gruppen gezeigt haben, dass neben der RNA, die Qualität von DNA und Proteinen aus NCFPE isoliert besser als die von FFPE Gewebe ⁸^,⁹^, ¹³.

Das Protokoll präsentiert folgt, soweit anwendbar (z. B. SBFS Rezept, Fixierung Bedingungen, RNA-Qualitätssicherung, Validierung), die Anforderungen der CEN technische Spezifikationen für pre-analytische Verfahren zur in-vitro- Diagnostika (IVD), die wurden vor kurzem vom Europäischen Ausschuss der Normung (CEN) veröffentlicht (z. B. CEN/TS 16827-1:2015 für RNA-Isolation aus FFPE Gewebe bezieht sich auf die Norm ISO 15189).

Die Methode beschränkt sich auf diese spezifische Fixiermittel. Obwohl die gute Erhaltung der Biomoleküle und Morphologie mit nicht-Cross-linking, Formalin-freie Fixiermittel in mehreren Studien vorgestellt wurde, wird es hauptsächlich in der Forschung aber nicht in Routine medizinische Anwendungen verwendet. Ein Grund ist, dass anstelle der Goldstandard SBFS Fixierung durch ein weiteres Fixiermittel eine Vielzahl von Validierungsstudien erfordern würde, da nicht alle Protokolle für Proteinkinase Material optimiert für Materialien mit nicht-Cross-linking Fixiermittel fixiert verwendbar sind. Andere Gewebe Fixierung Methoden wurden für dieses Fisch-Protokoll nicht getestet.

Der einfachen Post-Fixierung Schritt beschrieben in dieser Handschrift hat den Vorteil der Verwendung genehmigt IVD-Assays für Proteinkinase und NCFPE Gewebe.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Team des Labors für Molekulare Pathologie am Institut für Pathologie der medizinischen Universität Graz für ihre Expertise und Unterstützung. Darüber hinaus danken wir Iris Kufferath und Daniela Pabst für technische Hilfe, Bernadette Rieger und Sylvia Eidenhammer für die Verarbeitung der HER2-Fällen sowie Kinga Szurian (Pathologe) und Tamas Regényi (3DHISTEC). Wir danken für das Manuskript Korrektur Penelope Kungl. Diese Arbeit hat von Christian Doppler Forschungsfonds, des österreichischen Bundesministeriums für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft und der Nationalstiftung für Forschung, Technologie und Entwicklung finanziell unterstützt.

Materials

SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany	www.sav-lp.de	FN-200L-4-1	Tissue fixative
Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada	www.simport.com	M-498	Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765112	For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	813150	Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
Merck Millipore, Munich, Germany	www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html	MC1009834000	Dehydration of tissue samples
VWR Chemicals, Darmstadt, Germany	https://at.vwr.com	10293EP	Dehydration of tissue samples
ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria	www.herba-chemosan.at	2549662 32	Paraffin used in a tissue processing device
Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria	www.LeicaBiosystems.com	39602004	Paraffin embedding medium
Sanova Diagnostik, Vienna, Austria	www.sanova.at	5229	Paraffin embedding instrument for tissues for histology
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria	www.histocom.info	M 910010	This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark	www.chem.agilent.com	K802021-2	Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	73504	For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
Qiagen GmbH, Hilden Germany	www.qiagen.com	765134	For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany	www.zytovision.com	Z-2015-200	For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
3DHISTEC, Budapest, Hungary	www.3dhistech.com		Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4368814	The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4367659	PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE	www.thermofisher.com	Ser. Nr. F239	Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System	www.thermofisher.com	4485701	PCR machine,
Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A	www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order	e.g. (ThermoBrite) 07J91-020	Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

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Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

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