Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de medische universiteit van Graz (referentie nummer 20-066), Oostenrijk. Weefselsteekproeven werden twee gevallen van chirurgisch gereseceerd primaire invasieve borstkankers verkregen nadat de patiënten schriftelijke geïnformeerde toestemming had gegeven. 1. de weefsels fixatie Opmerking: Weefsel fixatie is uitgevoerd ofwel met standaard gebufferde formaline-oplossing (SBFS), gedefinieerd als 10% formaline-oplossing met een massafractie van 3,7% (overeenkomend met de breuk van een volume van 4%) formaldehyde gebufferd op een pH van 6.8 pH 7,2 volgens CEN/TS 16827-1:2015 of de niet-cross-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatie systeem (ook de alternatieve fixatie oplossing hieronder genoemd) bestaande uit een fixatief en een stabilisator oplossing bij kamertemperatuur (RT). Snijd de borst kanker weefselsteekproeven met een steriel scalpel in twee helften elk 4 mm dik om te zorgen voor voldoende weefsel hoeveelheid. Gebruik een maximumgrootte van 4 x 15 x 15 mm voor NCFPE of SBFS weefsel fixatie. Plaats elk halfjaar van het specimen van de tumor in een cassette standaard weefsel en het onderdompelen in SBFS of de alternatieve fixatie oplossing gedurende 24 uur met een volume per volumeverhouding (v/v) van 4 delen fixeer en enerzijds weefsel (4 mL/1 g weefsel (idealiter 10 mL/1 g)). Breng het alternatief-vaste monsters in de stabilisator oplossing voor 2-72 h door openen van de container, de cassette weefsel door 180° draaien en het dompelen. Plaats de cassettes van het weefsel met de monsters SBFS-fixed in 250 mL 70% ethanol voor 30 min op RT te verwijderen van de resterende SBFS.Opmerking: Deze stap is belangrijk om SBFS verontreiniging van niet-kruis-mailkoppeling fixeer-behandelde monsters in de geautomatiseerde weefsels-processor, die de heilzame eigenschappen van niet-kruis-mailkoppeling fixatives voor behoud van biomoleculen vernietigen zou te voorkomen.Let op: SBFS is een gevaarlijke oplossing veroorzaakt irritatie van de huid, ernstige oogbeschadigingen, de reactie van een allergische huid kan veroorzaken, wordt verdacht van het veroorzaken van genetische afwijkingen, kanker, irritatie van de luchtwegen, slaperigheid en veroorzaakt schade aan organen kan veroorzaken. De alternatieve fixeerspray is vergiftig bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond, irriterend voor de ogen en de huid, gevaar voor ernstige onherstelbare effecten bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond. Inhalatie- en fysiek contact moeten worden vermeden voor beide fixatie-oplossingen. Draag geschikte beschermende kleding, handschoenen en bescherming van de ogen en gezicht. Werken in een zuurkast. Ga naar bewerking, insluiten en weefsel segmenteren (punten 2 en 3). 2. de weefsels verwerking en insluiten Uitvoeren van de stapsgewijze uitdroging van weefsel cassettes met de vaste weefselmonsters in 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min) en ethanol 99% (2 x 60 min), gevolgd door xyleen (2 x 60 min). Vervolgens infiltreren met parafin in een geautomatiseerde weefsel processor (4 x 45 min). Plaats de uitgedroogd en paraffine-geïnfiltreerd monsters met pincet (alternatief en SBFS vaste) in metalen mallen. Insluiten van de monsters in 5-10 mL gesmolten paraffine (stollen punt 56-58 ° C) met behulp van een paraffine insluiten instrument. Plaats de mallen op een koeling bord bij-5 ° C gedurende 30 min. De blokken van paraffine-ingebedde weefsel herstellen van de mallen. Opslaan van de resulterende blokken (alternatief-vaste, paraffine-ingebedde (NCFPE) en SBFS-fixed paraffine-ingebedde (FFPE)) in het donker bij 4 ° C tot gebruik. 3. de weefsels segmenteren en dia voorbereiding voor vis Opmerking: FFPE secties worden direct gebruikt voor vis, terwijl dia’s met NCFPE secties post in SBFS voor 24 h vóór vis procedure worden vastgesteld. Een eenmalig gebruik mes in de microtoom invoegen en aanpassen van de microtoom aan 10 µm. Neem het eerste blok van de koeling plaat en het invoegen van het instrument. Trim het blok tot een egaal oppervlak is bereikt. Reinig de microtoom met een borstel en aan te passen aan 3 µm. Gooi de eerste 2-3 secties. Snij 3 µm secties van NCFPE en FFPE blokken en plaats ze in een bad met koud water (ultrazuiver water).Opmerking: Voor het verkrijgen van betere foto’s zonder overlappende kernen, hier, beelden van 2 µm secties in plaats van 3-5 µm zoals aanbevolen in de manufacturer´s-instructies worden weergegeven. Elke drijvende sectie met een fijne kwast en een naald op een gecoate microscoopglaasje voor de hechting van de weefselsecties halen. Deze dia duik in een warme (40 ° C) water bad en laat de sectie volledig strekken. De sectie terug op de dia door zorgvuldig de dia uit het water te trekken en voorkomen van rimpels. Laat die alle secties bij kamertemperatuur gedurende 1 uur drogen. Verwarm de dia’s bij 70 ° C gedurende 30 minuten in een incubator te smelten de paraffine. Zet de dia’s horizontaal in een glazen pot kleuring. Hydrateren de secties stapsgewijze op RT in de kleuring potten gevuld met 250 mL elke van de volgende vloeistoffen: 100% xyleen 2 x 15 min, 96% ethanol 90% ethanol 2 min, 80% ethanol 2 min, 70% ethanol 2 min, 50% ethanol, 2 x 15 min 2 min , en gedistilleerd water 2 x 10 min.Let op: Deparaffinization en rehydratie stappen uitvoeren in een zuurkast, giftige volatilized oplosmiddelen niet inademen.Opmerking: Afhankelijk van de secties en weefsel, het kan noodzakelijk zijn voor het testen van verschillende incubatie keer vooraf. 4. na fixatie van NCFPE specimens Na fixatie van NCFPE dia’s door ze te plaatsen in een nieuwe kleuring pot gevuld met SBFS gedurende 24 uur op RT. plaats de pot in een zuurkast tijdens de 24 h na fixatie stap uitvoeren De overtollige SBFS verwijderen door te wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (3 x 10 min) en gedestilleerd water (2 x 10 min). 5. fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) Opmerking: Hier vissen wordt uitgevoerd met behulp van de verkrijgbare HER2/CEN17 dual kleur sonde Kit volgens de instructies van de fabrikant. Laat niet de weefselsecties te drogen tijdens de kruising en wassen stappen. Laat niet de DNA sonde en 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA counterstain oplossingen aan het licht worden blootgesteld gedurende een langere periode. Voer deze stappen uit in het donker met behulp van Svetonepronitsaemyi containers. Afhankelijk van de leeftijd en de stap van de fixatie van het monstermateriaal, verhogen of verlagen de denaturering en wassen temperaturen om betere hybridisatie resultaten te verkrijgen. Plaats een kleuring pot met 250 mL warmte voorbehandeling oplossing citroenzuur in een waterbad van 98 ° C. Plaats de gerehydrateerd FFPE en na vaste NCFPE dia’s in de pot en incubeer gedurende 15 minuten.Gebruik niet meer dan zes dia’s per pot kleuring. Wassen van de dia’s in gedestilleerd water gedurende 3 minuten op RT in een nieuwe kleuring pot. Voor proteolyse, plaatst u de dia’s in een temperatuur gecontroleerde kruising systeem bij 37 ° C. Onmiddellijk, breng de-kant-en-klare pepsine oplossing (2mg/ml) ontkleuring (~ 30 µl per druppel) naar de weefselsecties totdat het volledig bedekt is. Incubeer gedurende 9 min bij 37 ° C in de kruising systeem.Opmerking: Een incubatietijd van 5-15 min wordt aanbevolen. De optimale tijd voor proteolyse moet vooraf worden vastgesteld. Plaats van de dia’s in een pot met was buffer SSC en incubeer gedurende 5 min. De dia’s in gedestilleerd water gedurende 1 min spoelen op RT. Uitvoeren van uitdroging van de secties in de volgende gesorteerde alcoholen: 50%, 70%, 90% en 100%, elk voor 1 min. lucht drogen de secties. Voor hybridisatie, Pipetteer 10 µL van HER2/CEN17 sonde naar de gedroogde weefselsecties, dekking van elk monster met een dekglaasje aan en verzegel het met rubber-cement.Opmerking: 10 µL van de sonde wordt aanbevolen per 22 x 22 mm weefsel gebied. Een zachte opwarming van de aarde van de sonde maakt de pipetting proces gemakkelijker. Vermijd bubbels en lange blootstelling van de sonde aan het licht. Co denatureren sonde en specimen DNA in het systeem van de kruising bij 75 ° C gedurende 10 minuten. De kruising systeem ingesteld op 37 ° C en ‘s nachts te vermengen. Verwijder voorzichtig het rubber-cement met een tang na kruising en opsporing. Incubeer de dia’s in een kleuring pot met 37 ° C vooraf opgewarmd 1 x wassen buffer A voor 5 min. verwijderen de coverslips. Wassen de dia’s met behulp van vooraf opgewarmd 1 x wassen buffer A tweemaal gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Uitdrogen van de dia’s in 70%, 90% en 100% ethanol, 1 minuten elk. De monsters in de lucht droog en beschermen tegen licht. Voor vlekken, breng 30 µL DAPI-oplossing voor het gehybridiseerde gebied vermijden van bubbels. Dekking van de secties met een dekglaasje aan. Incubeer gedurende 15 minuten beschermd tegen licht. Verwijder voorzichtig de overtollige DAPI-oplossing door zachtjes te drukken op de dia tussen filtreerpapier. De dia’s bij 2-8 ° C in het donker opslaan voor maximaal 2 weken tot evaluatie door confocale microscopie. 6. confocal imaging en scannen van dia’s van vis Uitvoeren van de confocal imaging en scannen van dia’s op een confocal digitale scanner is uitgerust met een 40 x / 1.2 nb objectief, quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) en een 5.5Mpx, 16 bit, gekoeld wetenschappelijke aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor (CMOS) camera. Verwerven van de beelden met filters voor groen (excitatie: 503 nm, emissie: 528 nm) en oranje (excitatie: 547 nm, emissie: 572 nm) kanalen. 7. interpretatie Opmerking: De sonde HER2/CEN17 is een mengsel van een rode fluorescerende gemerkt CEN17 sonde specifiek voor de regio Alfa satelliet centromeric van chromosoom 17 (D17Z1) en een groene fluorescerende-gelabelde HER2 sonde specifiek voor het HER2-gen (sonde locatie 17q12). Tumor specimens met een HER2:CEN17 verhouding ≤2.0 per kern worden gescoord als normaal, overwegende dat degenen met een HER2:CEN17 verhouding ≥2.0 als versterkte17worden gescoord. Het uitvoeren van de analyse van de kwaliteit van de beelden met de open source CaseViewer 2.120. Evalueren ten minste 20 cellen die zich in twee verschillende regio’s van de invasieve component van het carcinoom bevinden zoals gedefinieerd door een patholoog. Duidelijk te onderscheiden goed gedistribueerde kernen deelnemen aan het tellen gebied. Uitsluiten van het weefsel regio’s aan de grens en de ingeklapte of geperst gebieden tellen. 8. RNA kwaliteit RNA extractie Zorg ervoor dat alle instrumenten en hulpmiddelen RNAse gratis worden. Gebruik een oplossing RNAse-verwijderen. Knippen 10 tot 20 delen (5 µm dik) van NCFPE of FFPE monsters gebruikend microtome volgens het protocol tot stap 3.8. RNA uittreksel uit NCFPE monsters met behulp van de RNA-isolatie kit (Zie de tabel van materialen). Het uittreksel van RNA van FFPE monsters met behulp van een FFPE RNA isolatie kit.Opmerking: Extractie van RNA van niet-kruis-mailkoppeling fixatives vereist een isolatie-methode aangepast aan de fixatie-methode. Gebruik niet een andere RNA isolatie methode (bijvoorbeeld Trizol, RNeasy FFPE, etc. voor NCFPE model). Bepaal het RNA concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. De verhouding van de absorptie bij 260 nm en 280 nm (A260/280) moet worden ~ 2.0. De geïsoleerde RNA bij-70 ° C bewaren tot verdere analyse. Uitvoeren van een glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) real-time omgekeerde transcriptie PCR inleidingen gebruiken voor het genereren van waarbij van verschillende lengtes8,9. Gebruik een cDNA omgekeerde transcriptie kit volgens de instructies van de manufacturer´s voor cDNA synthese. Gebruik 500 ng RNA van elk monster. Bewaren cDNA bij-20 ° C tot verder gebruik. De master mix van PCR volgens de instructies van de manufacturer´s voor te bereiden. Pipetteer de master mix van PCR in triplicates in een 384-well reactie plaat. Toevoegen van 4 µL van 1:16 verdund cDNA (PCR sjabloon). De PCR volgens de instructies van de manufacturer´s uit te voeren.Opmerking: Voor menselijke GAPDH, werden de volgende inleidingen gebruikt: GAPDH naar voren: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH omgekeerde: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ en 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´. Analyseer de resultaten met behulp van een software die van toepassing zijn op de machine van PCR. Niet-specifieke producten moeten worden uitgesloten op basis van het smelten van de kromme analyse21.