詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

すべての実験は、動物（科学的手順）1986年の法と科学的手順における動物の使用のための実践の英国内務省コードを厳守で、プロジェクトのライセンス番号6004219の下で行われました。 1. PSM植解剖野生型（CD1）マウス13の時限交配によって生成された胚から尾組織を取得します。簡潔には、胚日（E）10.5で、二酸化炭素チャンバ内妊娠ドナーマウスを安楽死させます。子宮角を収穫し、ホームオフィスのライセンス手続きまたは同等のローカルルールに従い、1×滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中にそれを置きます。新鮮な、滅菌PBSを含む組織培養皿に子宮角を転送します。この溶液中の後続のすべての解剖の手順を実行します。 実体顕微鏡下では、湾曲したハサミを使用して子宮角の太い筋肉の膜をカットし、慎重に微細な鉗子を使用して、各胚を抽出します。世話をする尾の組織がこのプロセスにおいて損傷を受けないことを保証します。湾曲したハサミと細かい鉗子を使用して、各胚から羊膜嚢を離れて解剖、胚を傷つけないように注意しながら。 後部肢芽への胚の後方を切断することによって、各胚の尾組織を採取するために外科用針又は湾曲したハサミのいずれかを使用してください。 鉗子と針の両方を使用して、尾組織腹側を下にバランスをとります。正中線に沿って半分に尾組織を切開することにより、各胚の尾からPSMの外植片のペアを生成します。針で穏やかに揺動運動を行います。神経管、脊索、およびPSMの組織が均等に2外植片の間で分割されていることを確認してください。 予め温めた（37℃）培地少量の10％ウシ胎児血清（DMEM-F12 + 0.1％L-グルタミン代わりに35mmのプラスチック培養皿の蓋の下面にそれぞれ対PSM外植片をピペット、10 nMのヒトbFGF、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。 <LI>蓋の上に皿を置き、迅速PSM組織はメディアの「ハンギングドロップ」で蓋から吊り下げられているように、それを反転。文化1 37℃で加湿チャンバー内PSM植 – 2時間。 24ウェル組織培養プレートの個々のウェルにPSM植片の転送対。一晩、室温（RT）または4℃で1時間（O / N）をPBS中4％パラホルムアルデヒド中でインキュベートします。 注意 ：パラホルムアルデヒドは有毒であり、この溶液を用いて作業する場合、適切な安全対策が取られなければなりません。 注：24ウェル組織培養プレート内のすべてのその後の洗浄およびインキュベーションの手順を実行します。 4回 – 新鮮なPBS 3用のサンプル上のPBS溶液を交換するために微細なプラスチック製パスツールピペットを使用して、ロッキングプラットフォーム上でRTでPBS中のサンプルウェルを洗浄します。プロセス1 PSMの免疫組織化学を使用して、各ペアから外植（ステップ2）と知られている時計遺伝子（STのためのin situハイブリダイゼーションその他用いた蛍光EP 3）。 PSM外植片の2免疫組織化学ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間、PBS中2％のトリトンX-100で、ステップ1で生成された各胚のペアから1 PSM外植片を洗浄し、その後PBSで簡単にサンプルをすすいでください。溶液（PBS + 0.1％ツイーン20中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清（NGS））をブロッキングサンプルにPBSを交換し、ロッキングプラットフォーム上で、4℃でO / Nインキュベートします。 注：特に明記しない限り、このセクションのすべてのその後の洗浄およびインキュベーション工程は、ロッキングプラットフォーム上でRTで実行する必要があります。洗浄溶液は、簡単に先の細いプラスチックまたはガラスパスツールピペットを使用して変更することができます。 ワーキングバッファー中の所望の一次抗体/抗体を希釈し（0.1％BSA、0.3％NGS、そしてPBS中の0.2％トリトンX-100）。この例では、バッファを作業中のDLL1とのNotch1抗体1:25に希釈します。 注：最適化は、Th1に必要とされる適切な希釈係数を決定する必要があります代替抗体が使用される場合の手順。 ロッキングプラットフォーム上で4℃で5日間 – 3用の抗体溶液中の外植片をインキュベートします。二次抗体のコントロールとして機能するように何の一次抗体を含有しない作業用バッファを持ついくつかのサンプルを必ず含めるようにしてください。 ピペットを用いて1.5 mLの貯蔵管における一次抗体溶液を回収し、4℃で保存。 注：一次抗体を使用する抗体に依存して、数回使用することができる回収。 ロッキングプラットフォーム上でRTでPBS中2％トリトンX-100で10分間ずつ3回洗浄し、PBS中の10分間ずつ、 – 5のためのサンプルの2回の洗浄を行います。 蛍光標識された二次抗体/抗体を希釈バッファーを作業中（一次抗体へのエピトープがマッチした/抗体を使用します）。必要に応じて、核を対比染色するために、この溶液に、20μgの/ mLのヘキスト33342を追加します。 注：最適化は、この工程で必要とされる適切な希釈率を決定するために必要とされ得ます。この電子でXAMPLE、1の希釈係数400は、一般的に使用されました。 抗体凝集体の形成を防止するために、16×gで10分間、二次抗体溶液を遠心。抗体凝集体を含有することができる溶液の最後の数マイクロリットルを使用しないように注意しながら、各サンプルウェルに二次抗体溶液の500μL – 250を追加します。 暗所で4℃で5日間 – 光の露出を最小限に抑え、3のための二次抗体溶液中でサンプルをインキュベートするスズ箔とサンプルプレートをカバーしています。 実装サンプルをPBS中の0.1％のTween-20で10分間ずつ（PBST）およびロッキングプラットフォーム上で室温でPBSで一回で5分間二回のサンプルを洗う前に（ステップ4を参照）。 PSM外植片のin situハイブリダイゼーション（FISH）3.蛍光代替的な容器に保存されている場合は、24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに、残りの対PSM外植片を移します。 以下のためのサンプルを洗います10 PBST中50％エタノールで分、その後組織を脱水し、室温で揺動プラットフォーム上で、100％エタノールで10分間ずつ2回の洗浄を行います。 注：特に明記しない限り、このセクションのすべてのその後の洗浄およびインキュベーション工程は、ロッキングプラットフォーム上でRTで実行する必要があります。 PBSTで各5分間、2回洗浄し、続いてPBST中50％エタノールで10分間洗浄することによって、組織を再水和します。 注：ステップ3.2および3.3は、このプロトコルのために必要な必要な固定ステップであり、省略することはできません。 撹拌せずに5分間PBS（PBST）で0.1％のTween-20で10 / mlのプロテ​​イナーゼKでサンプルをインキュベートします。迅速プロテイナーゼKを除去し、PBSTで4％ホルムアルデヒド+ 0.1％グルタルアルデヒドで30分間組織を定着後の前にPBSTで簡単にサンプルをすすいでください。 注意：ホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドの両方は有毒であり、そしてこれらのソリューションで作業するときに適切な安全対策が取られなければなりません。 注：以下の洗浄50％と100％のハイブリダイゼーションミックス（3.6ステップ – 3.9）を含むインキュベーション工程は、攪拌せずに実行する必要があります。 50％ホルムアミド、5×生理食塩水 – クエン酸ナトリウム（SSC）、5mMのEDTA、50μg/ mlのtRNAを、10分間、二回PBSTで各サンプルを洗浄した後、一度イントロンプローブに適した50％のハイブリダイゼーション混合物（内のサンプルを洗いますPBST中の0.2％Tween-20を、0.1％SDS、および100μg/ mLのヘパリン）を室温で調製しました。攪拌せずに65℃で10分間この溶液中でサンプルをインキュベートします。 65℃で（48時間まで）≥2時間、ハイブリダイゼーション混合物中でサンプルをインキュベートする前に、予め温めた（65℃）ハイブリダイゼーション混合物で二回サンプルをすすぎ（より長いインキュベーション時間は、得られる信号対雑音コントラストを向上させます） 。前のステップからのハイブリダイゼーション混合物を取り外し、0.25に置き換える – ジゴキシゲニンを含む予め温めた（65℃）ハイブリダイゼーション混合物（DIG）の0.5 mLを知らセグメンテーション・クロック成分に対するアンチセンスRNAプローブを標識。 NOTE：例えば、イントロンルナティックフリンジ（Lfng（i））をプローブは、新生LfngのmRNAを検出するために、20μL/ mLの濃度で使用しました。この工程で使用される希釈は、プローブに依存し、最適化を必要とします。 蒸発を防ぎ、65℃で2泊プローブ溶液中の試料をインキュベートする粘着テープを使用してプレートをシール。 先の細いプラスチックパスツールピペットを使用して、再利用のためのプローブを回復し、20℃で保管してください。前に65℃で20分間、試料をさらに2回洗浄する前に、予め温めた（65℃）後、ハイブリダイゼーションミックス（50％ホルムアミド、0.2％のTween-20、および1×SSC）で2回サンプルをリンスポストハイブリダイゼーション混合物を温めました。 トリス緩衝生理食塩水（TBST）中の0.1％のTween-20で予め温めておいた50％のハイブリダイゼーション混合物中で65℃で15分間、試料を洗浄します。ロッキングプラットフォーム上でTBST中、室温で30分間洗浄する前に、TBSTで二回サンプルを洗浄します。 BLOでプレインキュベート外植弄ぶ天使液（TBST + 2％バッファー試薬（BBR）+ 20％熱処理ヤギ血清をブロッキング）2時間の最低。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の200希釈抗ジゴキシゲニン抗体を抱合：1を含む新鮮なブロッキング溶液でこのソリューションを交換してください。 4°CでサンプルO / Nインキュベートします。 抗体のインキュベーション後、室温で試料をTBSTで3回リンスし、新しい24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに移します。 1時間ごとに、TBSTで3回植片を洗います。 この時点で、チラミドシグナル増幅（TSA）は、以下のステップでの検出試薬の必要量を減少させるために0.5 mLの貯蔵チューブまたは48ウェル組織培養プレートの個々のウェルにサンプルを移します。 サンプルが完全に溶液中に浸漬されていることを確実に、できるだけ少量を使用して攪拌せずに1分間RTで（試薬リストを参照）TSA増幅緩衝液中でサンプルをインキュベートします。 （参照TSA試薬を追加します。1:50希釈でサンプル増幅バッファに試薬のリスト）。迅速TSA試薬が均等に分散されるまで、溶液を混合スズ箔でプレートまたはチューブをカバーし、60のためのサンプルをインキュベート – 暗所で90分。 TSA増幅溶液を除去し、5分間ずつTBSTで3回のサンプルを洗います。洗浄量を増加させ、1時間TBST中1％過酸化水素中でサンプルをインキュベートするバック24ウェル組織培養プレートに外植片を移します。 （ステップ4を参照）取り付けサンプリングする前にPBSTで5分間ずつ二回、その後TBSTでサンプルを5分間、3回ずつ洗浄し、。 イメージング用4.サンプルの調製カバーガラスの添加によって押しつぶされからサンプルを防ぐ0.12ミリ厚のイメージングスペーサを、追加することにより、各植片対について1帯電した接着ガラススライドを準備します。スペーサの一方の面から接着剤ライナーを取り外し、スライドガラス上に接着剤側を下に置き、Fを押しますirmlyスライドにスペーサーをシールします。 注：残りの手順については、光退色を避けるために、低光の中や暗闇の中でサンプルを維持するために努めています。外植片の解剖側がスライドに直面していることを確認して、スペーサの中心部内のガラスパスツールピペットを用いて調製したスライド上にピペットの外植片のペア。側によって外植側の反対側のペアを配置します。 ガラスパスツールピペットを用いてスライドからできるだけ多くの液体を除去し、折り畳まれた低リントティッシュ一枚の紙を使用して、サンプルを囲む任意の残留水分をオフに吸い上げます。 組織が粘着性と半透明表示され始めるまで、60秒 – サンプルは45のためのスライドに接着させます。この間、ピンセットを用いて、スペーサから残りの接着剤ライナーを削除します。サンプルを乾燥させないでください。 センター内のサンプルに（90％グリセロール、0.5％のp-フェニレンジアミンおよび20 mMトリス、pHが8.8、）二重機能の封入及びクリア溶液の大液滴を追加スペーサーの。注：酸化することを許可すると、このソリューションは、ブラック/ブラウンになります。 慎重に封入が均等に分散されていること、およびカバーガラスのすべてのエッジは、スペーサと接触することを確実にすること、サンプル全体に円形のカバースリップ（なし。1.5）を配置。いくつかの低リントティッシュペーパーの上に逆さまにカバースリップをスライドを置きます。 カバーガラスが完全にスペーサーに付着すると、余分な封入が除去されることを保証するために、しっかりと押し下げます。これ以上の封入ブロット紙まで繰り返します。 クリーンかつ適切にスライド（複数可）ラベル、およびイメージング-20℃で、短期的または-80℃で長期まで暗所に保管してください。ストレージからスライドを除去した後、彼らは完全にイメージングする前に解凍することができます。 画像タイル張りの取得と高倍率の対物レンズとの共焦点顕微鏡を使用してマウントのサンプル。画像植片対488-nmの、568-nmおよび647 nmのレーザー李を使用して、4μmのz軸間隔で40X油浸対物レンズを使用して、それぞれ、緑、赤、および遠赤色の蛍光色素分子を励起するNEは、タンパク質と本研究12中のmRNA検出のために使用します。 注：タイル張りの画像は、分析のために単一の画像を形成するために、買収後にステッチしました。 5.買収後の画像解析各実験サンプルのPSM内の関心領域を定義するために画像解析ソフトウェアを使用してください。 その後の定量化の前に非主要対照サンプルのレベルに発現レベル、減算背景閾値画像を定量化します。原点、軸、および各試料の単位長さを定義します。 M個のサンプル12のそれぞれの正規化吻側-尾側軸に沿った位置の関数としての蛍光強度を算出します。強度プロットを正規化した後、側によって強度プロファイル側に配置し、強度行列F（i、j）を取得iにおける強度を記述する<sサンプルj 番目の空間番目の位置>まで。 サンプルの6時間的順序既知のクロック成分の時間的順序を推測するには、その強度行列を定義します。時間的に周期的なパターンを得るために、その後、強度行列の列を並べ替えます。これを行うには、関数を定義します （F、J、K）はここで、f及びA Tのj 番目の列の自己相関関数を表すことにより、所定のパターンの時間的な周期性を強制するために選択された対象の自己相関関数であります関数gを最小限のサンプルの順序を識別するために、メトロポリス・ヘイスティングス（または別の最小化アルゴリズム）12を使用してください。このように、順序を決定します既知のクロック成分の時間的周期性を最大化するMサンプル。 Mサンプルの推論された時間的な順序付けを使用して、提携チャネル12内での発現パターンのために注文したカイモグラフを構築します。