Ordenamiento temporal de los datos de expresión dinámica de la expresión espacial detallada Mapas

Todos los experimentos se llevaron a cabo dentro del proyecto número de licencia 6004219 en estricta adhesión a los de 1986 y los Códigos del Ministerio del Interior del Reino Unido de prácticas para la utilización de animales en procedimientos científicos Animales (Procedimientos Científicos). 1. PSM explante Disección Obtener el tejido de la cola a partir de embriones producidos por el apareamiento temporizada de tipo salvaje (CD1) 13 ratones. En resumen, en el día embrionario (E) 10,5, la eutanasia el ratón donante embarazada en una cámara de dióxido de carbono. Se recoge el cuerno uterino y colocarlo en 1 x solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), de conformidad con los procedimientos de licencia del Ministerio del Interior o normas locales equivalentes. Transferir el cuerno uterino de una placa de cultivo de tejido que contenía fresca, PBS estéril. Realizar todos los pasos posteriores de disección en esta solución. Bajo un microscopio estereoscópico, cortar la membrana muscular gruesa de la trompa uterina con tijeras curvas y extraer cada embrión cuidadosamente usando pinzas finas. Cuídatepara asegurar que el tejido de la cola no está dañado en este proceso. Usando tijeras curvas y unas pinzas finas, diseccionar el saco amniótico de cada embrión, teniendo cuidado de no dañar el embrión. Utilice una aguja quirúrgica o tijeras curvas para cosechar el tejido de la cola de cada embrión mediante la reducción de la parte posterior del embrión a las yemas de las extremidades traseras. Equilibrar el ventral del lado del tejido de la cola hacia abajo con ambas pinzas y una aguja. Generar pares de explantes PSM de cada cola del embrión mediante la disección del tejido de la cola en dos mitades a lo largo de la línea media; realizar un movimiento de balanceo suave con una aguja. Asegúrese de que el tubo, notocorda y el tejido neuronal PSM se dividen por igual entre los dos explantes. Pipetear cada explante PSM contralateral en la parte inferior de un cultivo de plástico tapa de la placa de 35 mm en un pequeño volumen de pre-calentado (37 ° C) medio de cultivo (DMEM-F12 + 0,1% sustituto de L-glutamina suplementado con suero de ternera fetal al 10% , 10 nM bFGF humano, y 1% de penicilina / estreptomicina). <li> Coloque el plato en la parte superior de la tapa y rápidamente invertir de modo que el tejido PSM se suspende de la tapa en una "gota colgante" de medio. La cultura de los explantes de PSM en una cámara húmeda a 37 ° C durante 1 – 2 h. pares de transferencia de explantes PSM a los pocillos individuales de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Incubar en 4% de paraformaldehído en PBS durante 1 h a temperatura ambiente (RT) o 4 ° C durante la noche (O / N). PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico, y las medidas de seguridad apropiadas se debe tomar cuando se trabaja con esta solución. NOTA: Realizar todos los pasos de lavado e incubación posterior en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Lavar los pocillos de muestras en PBS a temperatura ambiente en una plataforma oscilante, usando una pipeta fina de plástico Pasteur para el intercambio de la solución de PBS de las muestras de PBS fresco 3 – 4 veces. Procesar un explante PSM de cada par mediante inmunohistoquímica (paso 2) y el otro usando hibridación fluorescente in situ para un gen conocido reloj (step 3). 2. Inmunohistoquímica de PSM explantes Lavar un explante PSM de cada par de embriones generados en el paso 1 en el 2% de Triton X-100 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente en una plataforma oscilante, y luego enjuague muestras brevemente en PBS. Sustituir el PBS en las muestras con solución de bloqueo (albúmina de 2% de suero bovino (BSA) y 10% de suero normal de cabra (NGS) en PBS + 0,1 Tween-20%) y se incuba O / N a 4 ° C en una plataforma oscilante. NOTA: Todos los lavados posteriores y las etapas de incubación de esta sección deben llevarse a cabo a temperatura ambiente en una plataforma oscilante, a menos que se indique lo contrario. soluciones de lavado se pueden cambiar fácilmente con un plástico o vidrio pipeta Pasteur de punta fina. Diluir el anticuerpo / anticuerpos primarios deseados en tampón de trabajo (0,1% de BSA, 0,3% NGS, y 0,2% de Triton X-100 en PBS). En este ejemplo, diluir los anticuerpos Dll1 y Notch1 1:25 en tampón de trabajo. Se requerirá de optimización para determinar el factor de dilución apropiado requerido en thi: NOTAs paso si se utilizan anticuerpos alternativos. Incubar los explantes en la solución de anticuerpo durante 3 – 5 días a 4 ° C en una plataforma oscilante. Asegúrese de incluir algunas muestras con tampón de trabajo que contenía ningún anticuerpo primario para actuar como controles de anticuerpos secundarios. Recuperar la solución de anticuerpo primario en un tubo de almacenamiento de 1,5 ml con una pipeta y almacenarlo a 4 ° C. NOTA: Recuperado anticuerpo primario se puede utilizar varias veces, dependiendo del anticuerpo utilizado. Realizar 2 lavados de las muestras de 5 – 10 min cada uno en PBS, seguido de 3 lavados de 10 min cada uno en 2% de Triton X-100 en PBS a RT en una plataforma oscilante. Diluir anticuerpo / anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (epítopo corresponde con el anticuerpo primario / anticuerpos utilizados) en tampón de trabajo. Opcionalmente, añadir 20 g / ml de Hoechst 33342 a esta solución para contrateñir los núcleos. NOTA: Optimización puede ser necesaria para determinar el factor de dilución apropiado requerido en este paso. En este correojemplo, un factor de dilución de 1: se utiliza típicamente 400. Centrifugar la solución de anticuerpo secundario durante 10 min a 16 xg para evitar la formación de agregados de anticuerpos. Añadir 250 – 500 l de la solución de anticuerpo secundario a cada pocillo de muestra, teniendo cuidado de no utilizar los últimos microlitros de la solución, que puede contener agregados de anticuerpos. Cubrir la placa de la muestra con papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz e incubar las muestras en la solución de anticuerpo secundario durante 3 – 5 días a 4 ° C en la oscuridad. Antes de muestrear de montaje, lavar las muestras dos veces durante 10 min cada uno en 0,1% de Tween-20 en PBS (PBST) y una vez por 5 min en PBS a RT en una plataforma oscilante (ver paso 4). 3. La hibridación in situ fluorescente (FISH) de PSM explantes Si se almacena en un recipiente alternativa, la transferencia de los restantes explantes PSM contralaterales a los pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Se lavan las muestras para10 min en etanol al 50% en PBST, y luego realizar 2 lavados de 10 minutos cada una en etanol al 100% en una plataforma oscilante a temperatura ambiente para deshidratar el tejido. NOTA: Todos los lavados posteriores y las etapas de incubación de esta sección deben llevarse a cabo a temperatura ambiente en una plataforma oscilante, a menos que se indique lo contrario. Rehidratar el tejido mediante el lavado de 10 min en etanol al 50% en PBST, seguido de lavado dos veces durante 5 min cada uno en PBST. NOTA: Los pasos 3.2 y 3.3 son medidas de fijación necesarios que se requieren para este protocolo y no se puede omitir. Se incuban las muestras con 10 mg / ml de proteinasa K en 0,1% de Tween-20 en PBS (PBST) durante 5 min sin agitación. eliminar rápidamente la proteinasa K y enjuagar las muestras brevemente con PBST antes de post-fijación del tejido durante 30 minutos en 4% de formaldehído + 0,1% de glutaraldehído en PBST. PRECAUCIÓN: Tanto el formaldehído y el glutaraldehído son tóxicos, y las medidas de seguridad apropiadas se deben tomar cuando se trabaja con estas soluciones. NOTA: La siguiente lavadoy que involucran las etapas de incubación de 50% y 100% mezclas de hibridación (pasos 3.6 a 3.9) deben llevarse a cabo sin agitación. Después de lavar las muestras dos veces durante 10 min cada uno en PBST, lavar las muestras de una vez en 50% de mezcla de hibridación (adecuado para sondas intrónicas: 50% de formamida, 5x citrato de solución salina de sodio (SSC), EDTA 5 mM, 50 mg / ml tRNA, 0,2% de Tween-20, 0,1% de SDS, y 100 mg / ml de heparina) en PBST preparan a TA. Se incuban las muestras en esta solución durante 10 min a 65 ° C sin agitación. Enjuagar las muestras dos veces con pre-calentado (65 ° C) mezcla de hibridación antes de la incubación de las muestras en mezcla de hibridación durante ≥ 2 h (hasta 48 h) a 65 ° C (tiempos de incubación más largos mejoran el contraste de señal a ruido resultante) . Retire la mezcla de hibridación de la etapa anterior, y reemplazarlo con 0,25 – 0,5 mL de pre-calentado (65 ° C) mezcla de hibridación que contiene un digoxigenina (DIG) marcado con sonda de ARN antisentido contra un componente de reloj segmentación conocido. NOE: Por ejemplo, una franja loca intrónica (Lfng (i)) de la sonda se utilizó a una concentración de 20 l / ml para detectar mRNA Lfng naciente. La dilución utilizado en esta etapa es la sonda dependiente y requerirá la optimización. Sellar la placa con cinta adhesiva para evitar la evaporación e incubar las muestras en la solución de la sonda durante dos noches a 65 ° C. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico de punta fina, recuperar la sonda para su reutilización y almacenarlo a 20 ° C. Enjuagar las muestras dos veces con pre-calentado (65 ° C) mezcla post-hibridación (50% formamida, 0,2% de Tween-20, y 1x SSC) antes de lavar las muestras dos veces más durante 20 minutos cada uno a 65 ° C en pre- calentado mezcla de post-hibridación. Lavar las muestras durante 15 minutos a 65 ° C en mezcla de hibridación precalentada 50% en 0,1% de Tween-20 en solución salina tamponada con Tris (TBST). Enjuagar las muestras dos veces con TBST antes de lavar durante 30 minutos a RT en TBST en una plataforma oscilante. Preincubarlos los explantes en blosolución cking (TBST + 2% de reactivo de bloqueo tampón (BBR) + suero de cabra tratada térmicamente 20%) durante un mínimo de 2 h. Reemplazar esta solución con solución de bloqueo fresco que contiene una dilución 1: 200 de peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo anti-digoxigenina. Se incuban las muestras de O / N a 4 ° C. Después de la incubación del anticuerpo, enjuagar las muestras 3 veces con TBST a temperatura ambiente y transferirlos a pocillos individuales de una nueva placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Lavar los explantes con TBST 3 veces durante 1 hora cada uno. En este punto, la transferencia de las muestras en tubos de 0.5 ml de almacenamiento o los pocillos individuales de una placa de cultivo tisular de 48 pocillos para reducir el volumen requerido de los reactivos de detección de amplificación de señal de tiramida (TSA) en los pasos siguientes. Incubar las muestras en tampón de amplificación TSA (véase la lista de reactivos) a TA durante 1 min sin agitación usando un volumen lo más pequeño posible, lo que garantiza que las muestras están totalmente sumergidos en la solución. Añadir el reactivo TSA (véase elLista de reactivos) al tampón de amplificación de la muestra a una dilución de 1:50. mezclar rápidamente la solución hasta que el reactivo de TSA se distribuye uniformemente, cubrir la placa o los tubos en papel de aluminio, y se incuban las muestras durante 60 – 90 min en la oscuridad. Eliminar la solución de amplificación TSA y lavar las muestras en TBST 3 veces durante 5 minutos cada uno. La transferencia de los explantes de nuevo a una placa de cultivo tisular de 24 pocillos para incrementar el volumen de lavado e incubar las muestras en peróxido de hidrógeno al 1% en TBST durante 1 h. Lavar las muestras con TBST 3 veces durante 5 min cada uno, y luego dos veces durante 5 minutos cada uno con PBST antes de la muestra de montaje (ver paso 4). 4. Preparación de muestras para Imaging Preparar un portaobjetos de vidrio cargado de adhesión para cada par explante mediante la adición de espaciadores de imagen de espesor 0,12 mm, que evitan que las muestras de ser aplastado por la adición de un cubreobjetos. Retirar el revestimiento adhesivo de una superficie de un espaciador y colocarlo del lado adhesivo hacia abajo sobre un portaobjetos de vidrio, presionando firmly para sellar el espaciador a la diapositiva. NOTA: Para los pasos restantes, esforzarse por mantener las muestras en condiciones de poca luz o en la oscuridad para evitar photobleaching. pares de explantes de pipeta en un portaobjetos preparado usando una pipeta Pasteur de vidrio en el centro del espaciador, lo que garantiza que el lado diseccionado del explante se enfrenta a la corredera. Organizar pares contralateral de lado a lado explantes. Eliminar la mayor cantidad de líquido posible de la diapositiva utilizando una pipeta Pasteur de vidrio y absorber toda la humedad residual que rodea las muestras usando un pedazo de papel de seda bajo pelusa plegada. Permitir que las muestras se adhieran a la corredera durante 45 – 60 s, hasta que el tejido empieza a aparecer pegajoso y translúcido. Durante este tiempo, retirar el forro adhesivo restante del espaciador con unas pinzas. No permita que las muestras se sequen. Añadir una gran gota de medio de montaje de doble función y la solución de limpieza (0,5% de p-fenilendiamina y Tris 20 mM, pH 8,8, en 90% de glicerol) a las muestras dentro del centrodel espaciador. NOTA: Esta solución se vuelve marrón / negro cuando está permitido para oxidar. Colocar con cuidado un cubreobjetos circular (no. 1.5) a través de las muestras, asegurando que el medio de montaje se distribuye uniformemente y que todos los bordes del cubreobjetos hacer contacto con el espaciador. Coloque la tapa deslizante-deslizado al revés sobre un poco de papel de tejido bajo pelusa. Presione firmemente hacia abajo para asegurarse de que el cubreobjetos se adhiere totalmente al separador y que se elimina cualquier exceso de medio de montaje. Repetir hasta que no hay más manchas de montaje que el papel. Limpia y la etiqueta de la diapositiva (s) apropiada, y almacenarlos en la oscuridad hasta la imagen, a corto plazo a -20 ° C o largo plazo a -80 ° C. Después de eliminar las diapositivas de almacenamiento, permiten que se descongelen completamente antes de exponer. Imagen de las muestras montadas utilizando un microscopio confocal con la adquisición de baldosas y un objetivo de alta magnificación. La imagen de los pares de explantes utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40X a 4 micras-z intervalos utilizando 488 nm, 568 nm y 647 nm láser de lines para excitar los fluoróforos verde, rojo, y rojo lejano, respectivamente, empleadas para la proteína y la detección de mRNA en este estudio 12. NOTA: baldosas imágenes fueron cosidos posterior a la adquisición para formar una sola imagen para su análisis. 5. posteriores a la adquisición de Análisis de Imágenes Utilice el software de análisis de imágenes para definir una región de interés dentro del PSM de cada muestra experimental. Para cuantificar los niveles de expresión, fondo de resta y las imágenes de umbral para el nivel de una muestra de control no-primario antes de la cuantificación subsiguiente. Definir un origen, un eje, y una unidad de longitud para cada muestra. Calcular la intensidad de fluorescencia como una función de posición a lo largo del eje rostro-caudal normalizado para cada una de las M muestras 12. Después de la normalización de las parcelas de intensidad, coloque el lado perfiles de intensidad a lado y obtener una matriz de intensidad de f (i, j) que describe la intensidad en el i <sarriba> ª posición espacial en la j-ésima muestra. 6. ordenación temporal de las Muestras Para inferir ordenamiento temporal de un componente de reloj conocida, definir su matriz de intensidad. Entonces, reorganizar las columnas de la matriz de intensidad a fin de obtener un patrón temporal periódica. Para ello, definir la función donde A (j f; k) representa la función de autocorrelación de la j-ésima columna de f y A T es una función de autocorrelación objetivo, elegido para hacer cumplir la periodicidad temporal del patrón, dada por Utilice el Metropolis-Hastings (u otro algoritmo de minimización) 12 para identificar el orden de las muestras que minimizan la función g. Por lo tanto, determinar el orden de laM muestras que maximiza la periodicidad temporal de un componente de reloj conocido. Utilizando el ordenamiento temporal inferido de las muestras M, construir un quimógrafo ordenada por el patrón de expresión en el canal 12 con pareja.