Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

Todos os experimentos foram realizados no âmbito do projecto número de licença 6004219 em estrita observância às Animais (procedimentos científicos) Act de 1986 e os códigos UK Home Office de Boas Práticas para o uso de animais em procedimentos científicos. 1. PSM Explant Dissection Obter o tecido da cauda a partir de embriões produzidos pelo acoplamento temporizada do tipo selvagem (CD1) 13 ratinhos. Resumidamente, no dia embrionário (E) 10,5, eutanásia do camundongo doador grávida em uma câmara de dióxido de carbono. Colher o corno uterino e colocá-lo em solução de 1X solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS), em conformidade com os procedimentos de licença Home Office ou regras locais equivalentes. Transferir o corno uterino a um prato de cultura de tecidos contendo fresco, PBS estéril. Execute todas as etapas de dissecção subsequentes nesta solução. Sob um microscópio estereoscópico, cortar a membrana muscular grossa do corno uterino utilizando tesoura curva e extrair cada embrião com cuidado usando uma pinça fina. Cuidarpara garantir que o tecido da cauda não é danificado durante este processo. Usando tesoura curva e uma pinça fina, dissecar afastado o saco amniótico de cada embrião, tomando cuidado para não danificar o embrião. Use uma agulha cirúrgica ou tesoura curva para colher o tecido da cauda de cada embrião, cortando a posterior embrião para os brotos dos membros traseiros. Equilibrar o tecido da cauda ventral do lado para baixo, usando ambos os fórceps e uma agulha. Gerar pares de explantes PSM de cada cauda embrionária dissecando o tecido da cauda em duas metades ao longo da linha média; executar um movimento de balanço suave com uma agulha. Certifique-se de que o tubo, notocorda, e tecido neural PSM são divididos igualmente entre os dois explantes. Pipetar cada explante PSM contralateral sobre o lado inferior de uma tampa de placa de cultura de plástico de 35 mm em um pequeno volume de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura (DMEM-F12 + 0,1% de L-glutamina substituto suplementado com soro de vitelo fetal a 10% , 10 nM de bFGF humano, e 1% de penicilina / estreptomicina). <li> Colocar a cápsula no topo da tampa e rapidamente invertê-lo de modo que o tecido de PSM é suspenso a partir da tampa em uma "gota em suspensão" de meio. Cultura os explantes PSM numa câmara humidificada a 37 ° C durante 1 – 2 h. pares de transferência de explantes PSM aos poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Incubar em paraformaldeído a 4% em PBS durante 1 h à temperatura ambiente (TA) ou a 4 ° C durante a noite (O / N). CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico, e devem ser tomadas medidas de segurança adequadas ao trabalhar com esta solução. NOTA: Executar todas as etapas de lavagem e posterior incubação em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Lavar os poços de amostras em PBS à temperatura ambiente numa plataforma oscilante, usando uma pipeta de Pasteur de plástico fino para trocar a solução de PBS nas amostras de PBS fresco de 3 – 4 vezes. Processar um explante de PSM de cada par usando imuno-histoquímica (passo 2) e o outro utilizando hibridização in situ fluorescente por um gene conhecido de relógio (rEP 3). 2. A imuno-histoquímica de explantes PSM Lavar um explante de PSM de cada par embrionário gerado no passo 1 em 2% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à temperatura ambiente numa plataforma de agitação, e em seguida enxaguar as amostras brevemente em PBS. Substituir o PBS nas amostras com solução de bloqueio (albumina de 2% de soro de bovino (BSA) e soro de cabra normal a 10% (NGS) em PBS + 0,1% de Tween-20) e incubar O / N a 4 ° C numa plataforma oscilante. NOTA: Todas as lavagens subsequentes e as etapas de incubação desta seção devem ser realizados à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço, salvo indicação contrária. soluções de lavagem pode ser facilmente alterado através de um plástico ou de vidro Pasteur pipeta de ponta fina. Dilui-se o anticorpo / anticorpos primários desejadas em tampão de trabalho (0,1% de BSA, 0,3% NGS, e 0,2% de Triton X-100 em PBS). Neste exemplo, os anticorpos diluir 1:25 DLL1 Notch1 e em tampão de trabalho. NOTA: Optimization serão necessários para determinar o fator de diluição adequada exigida nos this etapa se anticorpos alternativos são usados. Incubar em explantes a solução de anticorpo durante 3 – 5 dias, a 4 ° C numa plataforma oscilante. Certifique-se de incluir algumas amostras com tampão de trabalho que não contém o anticorpo primário para atuar como controles de anticorpos secundários. Recuperar a solução de anticorpo primário em um tubo de armazenamento de 1,5 ml usando uma pipeta e armazená-lo a 4 ° C. NOTA: Recuperado anticorpo primário pode ser utilizado várias vezes, dependendo do anticorpo usado. Realizar 2 lavagens de amostras de 5 – 10 minutos cada em PBS, seguido de 3 lavagens de 10 minutos cada em 2% de Triton X-100 em PBS a RT numa plataforma oscilante. Diluir anticorpo / anticorpos secundários marcados com fluorescência (epitopo-combinado com o anticorpo primário / anticorpos utilizados) em tampão de trabalho. Opcionalmente, adiciona-se 20 ug / ml Hoechst 33342 a esta solução para contracoloração os núcleos. NOTA: Optimização podem ser necessários para determinar o factor de diluição adequado necessário neste passo. Neste example, um factor de diluição de 1: 400 foi tipicamente utilizado. Centrifugar a solução de anticorpo secundário durante 10 min a 16 xg para evitar a formação de agregados de anticorpos. Adicionar 250 – 500 ul da solução de anticorpo secundário em cada poço de amostra, tendo o cuidado de não usar os últimos poucos microlitros da solução, que pode conter agregados de anticorpos. Cobrir a placa com folha de estanho amostra para minimizar a exposição à luz e incubar as amostras na solução de anticorpo secundário durante 3 – 5 dias a 4 ° C no escuro. Antes da amostra de montagem, lavar as amostras duas vezes durante 10 minutos cada, em 0,1% de Tween-20 em PBS (PBST) e uma vez durante 5 min em PBS, à TA numa plataforma oscilante (ver passo 4). 3. fluorescente hibridação in situ (FISH) de PSM explantes Se armazenado num vaso alternativa, transferir os explantes restantes PSM contralaterais aos poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Lavam-se as amostras para10 min em etanol a 50% em PBST, e, em seguida, executar 2 lavagens de 10 minutos cada em etanol a 100% numa plataforma de agitação à TA a desidratar o tecido. NOTA: Todas as lavagens subsequentes e as etapas de incubação desta seção devem ser realizados à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço, salvo indicação contrária. Re-hidratar o tecido por lavagem durante 10 min em etanol a 50% em PBST, seguindo-se lavagem duas vezes durante 5 min cada em PBST. NOTA: Os passos 3.2 e 3.3 são passos de fixação necessários para este protocolo e não pode ser omitida. Incubar as amostras com 10 ug / ml de proteinase K em 0,1% de Tween-20 em PBS (PBST) durante 5 minutos, sem agitação. remover rapidamente a proteinase K e lavar as amostras brevemente com PBST antes de pós-fixação do tecido durante 30 minutos em formaldeído 4% + 0,1% de glutaraldeído em PBST. ATENÇÃO: Tanto o formaldeído e glutaraldeído são tóxicos e devem ser tomadas medidas de segurança adequadas quando se trabalha com estas soluções. NOTA: A lavagem seguintee envolvendo os passos de incubação de 50% e 100% misturas de hibridação (passos 3,6-3,9) deve ser realizada sem agitação. Após lavagem das amostras duas vezes durante 10 minutos cada em PBST, lavar as amostras de uma vez em 50% de mistura de hibridação (adequado para sondas intrónicas: 50% de formamida, 5x citrato de salina de sódio (SSC), 5 mM de EDTA, 50 ug / ml de ARNt, 0,2% de Tween-20, 0,1% de SDS, e 100 ug / mL de heparina) em PBST preparado à TA. Incubar as amostras nesta solução durante 10 min a 65 ° C sem agitação. Lavar as amostras duas vezes com (65 ° C) mistura de hibridação pré-aquecido antes da incubação das amostras na mistura de hibridação de @ 2 h (até 48 h) a 65 ° C (tempos de incubação mais longos melhorar o contraste de sinal-para-ruído resultante) . Retirar a mistura de hibridação a partir do passo anterior, e substituí-la com 0,25-0,5 mL de pré-aquecido (65 ° C) uma mistura de hibridação contendo digoxigenina (DIG) marcado com sonda de RNA anti-sentido contra um componente de relógio da segmentação conhecido. NÃOE: Por exemplo, uma franja excêntrica intrónica (Lfng (i)) sonda foi utilizada a uma concentração de 20 uL / mL para detectar ARNm Lfng nascente. A diluição utilizado neste passo é dependente da sonda e irá requerer optimização. Selar a placa usando fita adesiva para evitar a evaporação e incubar as amostras na solução de sonda para duas noites a 65 ° C. Usando uma pipeta de Pasteur de plástico de ponta fina, recuperar a sonda para a reutilização e armazená-lo em 20 ° C. Lavar as amostras duas vezes com pré-aquecido (65 ° C) mistura pós-hibridação (formamida a 50%, 0,2% de Tween-20, e 1x SSC) antes da lavagem das amostras mais duas vezes durante 20 minutos cada, a 65 ° C em pré- aquecido mix pós-hibridação. Lavam-se as amostras durante 15 min a 65 ° C na mistura de hibridação pré-aquecida até 50% em 0,1% de Tween-20 em solução salina tamponada com Tris (TBST). Lavar as amostras duas vezes com TBST antes da lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em TBST numa plataforma oscilante. Pré-incubar os explantes em blosolução cking (TBST + 2% de reagente de bloqueio tampão (BBR) + soro de cabra tratado termicamente de 20%) por um período mínimo de 2 h. Substituir esta solução com solução de bloqueio fresco contendo uma diluição 1: 200 de peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo anti-digoxigenina. Incubar as amostras o / n a 4 ° C. Após a incubação do anticorpo, lavar as amostras 3 vezes com TBST, à TA e transferi-los para poços individuais de uma nova placa de 24 poços de cultura de tecidos. Lavar os explantes com TBST 3 vezes durante 1 hora cada. Neste ponto, transferir as amostras para tubos de 0,5 mL de armazenagem ou a poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços para reduzir o volume requerido de os reagentes de detecção de amplificação de sinal Tyramide (TSA) nos seguintes passos. Incubar as amostras em tampão de amplificação de TSA (ver a lista de reagentes) à temperatura ambiente durante 1 min sem agitação utilizando como pequeno volume possível, assegurando que as amostras são totalmente imerso na solução. Adiciona-se reagente TSA (ver alista de reagentes) para o tampão de amostra de amplificação, a uma diluição de 1:50. misturar rapidamente a solução até que o reagente de TSA está uniformemente distribuída, cobrir a placa de tubos ou em folha de alumínio, e incubar as amostras durante 60 – 90 min no escuro. Remover a solução de amplificação TSA e lavar as amostras em TBST 3 vezes durante 5 minutos cada. Transferir os explantes de volta para uma placa de cultura de tecidos de 24 poços para aumentar o volume de lavagem e incubar as amostras em peróxido de hidrogénio a 1% em TBST durante 1 h. Lavam-se as amostras com TBST 3 vezes durante 5 min cada, e depois duas vezes durante 5 min cada com PBST antes da amostra de montagem (ver passo 4). 4. Preparação de Amostras for Imaging Prepare uma corrediça adesão de vidro carregada para cada par de explante através da adição de 0,12 mm de espessura espaçadores de imagem, que impedem que as amostras de ser esmagado pela adição de uma lamela. Remover o revestimento adesivo de uma superfície de um espaçador e colocá-lo adesiva virada para baixo sobre uma lâmina de vidro, pressionando firmly para selar o espaçador para a corrediça. NOTA: Para as etapas restantes, se esforçar para manter as amostras em condições de pouca luz ou na escuridão para evitar a fotodegradação. Pipeta pares de explantes numa lâmina preparada utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro dentro do centro do espaçador, garantindo que o lado dissecado do explante está virado para a corrediça. Organizar pares contralateral do lado explantes a lado. Remover o máximo de líquido possível a partir do slide usando uma pipeta Pasteur de vidro e pavio fora qualquer umidade residual em torno das amostras utilizando um pedaço de papel de seda low-lint dobrado. Permitir que as amostras para aderir à lâmina de 45 – 60 s, até que o tecido começa a aparecer pegajosa e translúcida. Durante este tempo, remover o revestimento adesivo remanescente do espaçador usando uma pinça. Não permita que as amostras a secar. Adicionar uma grande gota de montagem de dupla função e solução de limpeza (0,5% de p-fenilenodiamina e Tris 20 mM, pH 8,8, em 90% de glicerol) para as amostras dentro do centrodo espaçador. NOTA: Esta solução fica marrom / preta quando permitido para oxidar. Com cuidado, coloque uma lamela circular (no. 1.5) através das amostras, assegurando que a montagem é distribuído uniformemente e que todas as bordas da lamela fazer contato com o espaçador. Coloque o slide escorregou-cover de cabeça para baixo em algum papel de tecido low-lint. Pressionar firmemente para assegurar que a lamela adere totalmente ao espaçador e que qualquer excesso é removido para montagem. Repita até que não há manchas mais compostos para montagem do papel. Limpo e rotular o slide (s) de forma adequada, e armazená-los no escuro até de imagem, a curto prazo a -20 ° C ou a longo prazo a -80 ° C. Depois de remover os slides de armazenamento, permitir-lhes para descongelar completamente antes de imagem. Imagem as amostras montadas usando um microscópio confocal com a aquisição de azulejos e uma objectiva grande ampliação. Imagem dos pares de explantes usando uma objectiva de imersão em óleo de 40X em Z-intervalos de 4 ^ m usando 488 nm, 568 nm e 647 nm li a lasernes para excitar os verdes, vermelhas, e far-vermelhos fluoróforos, respectivamente, utilizados para proteínas e detecção de mRNA neste estudo 12. NOTA: Telhado imagens foram costurados pós-aquisição para formar uma imagem única para análise. 5. Pós-aquisição Análise de Imagem Use software de análise de imagem para definir uma região de interesse dentro do PSM de cada amostra experimental. Para quantificar os níveis de expressão, de fundo e de subtracção de imagens de limiar para o nível de uma amostra de controlo não-primária antes da quantificação subsequente. Definir uma origem, um eixo, e uma unidade de comprimento para cada amostra. Calcula-se a intensidade de fluorescência como uma função da posição ao longo do eixo rostro-caudal normalizado para cada uma das amostras M 12. Depois de normalizar as parcelas de intensidade, colocar lado a lado por perfis de intensidade e se obter uma matriz de intensidade f (i, j), que descreve a intensidade no i <sup> th posição espacial na j th amostra. 6. ordenação temporal de Amostras Para inferir ordenação temporal de um componente do relógio conhecido, definir a sua matriz de intensidade. Em seguida, reorganizar as colunas da matriz de intensidade, de modo a obter um padrão periódico temporalmente. Para fazer isso, definir a função em que A (f j; k) representa a função de autocorrelação de ordem j a coluna de f e uma t é uma função de autocorrelação alvo, escolhida para aplicar a periodicidade temporal do padrão, dada pela Utilizar a Metropolis-Hastings (ou outro algoritmo de minimização) 12 para identificar a ordem das amostras que minimizam a função g. Assim, determinar a ordem daM amostras que maximiza a periodicidade temporal de uma componente de relógio conhecido. Usando a ordenação temporal inferida das amostras M, construir um quimógrafo encomendados para o padrão de expressão no canal partnered 12.