Temporale ordinazione di espressione Dynamic Data di espressione spaziale dettagliata Mappe

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in progetto il numero di licenza 6.004.219 in stretta aderenza agli animali (procedure scientifiche) Act del 1986 ei codici del Regno Unito Ministero degli Interni di pratica per l'uso di animali nelle procedure scientifiche. 1. PSM Espianto Dissection Ottenere il tessuto coda da embrioni prodotti dalla accoppiamento a tempo di wild-type (CD1) topo 13. Brevemente, al giorno embrionale (E) 10.5, eutanasia il topo donatore incinta in una camera di anidride carbonica. Raccogliere il corno uterino e posizionarlo nella soluzione 1x sterile PBS (PBS), secondo le procedure di licenza del Ministero degli o norme locali equivalenti. Trasferire il corno uterino ad un piatto di coltura di tessuti contenenti fresco, PBS sterile. Eseguire tutte le successive fasi di dissezione in questa soluzione. Sotto uno stereomicroscopio, tagliare la membrana muscolare spessore del corno uterino con le forbici curve ed estrarre ogni embrione con cura utilizzando una pinza sottile. Stai attentoper garantire che il tessuto coda non è danneggiato in questo processo. Utilizzando forbici curve e una pinza sottile, sezionare via il sacco amniotico da ogni embrione, facendo attenzione a non danneggiare l'embrione. Utilizzare un ago chirurgico o forbici curve per raccogliere il tessuto coda di ogni embrione tagliando posteriore dell'embrione alle gemme degli arti posteriori. Bilanciare il tessuto coda ventrale rivolto verso il basso con entrambe le pinze e un ago. Generare coppie di PSM espianti da ogni coda embrionale sezionando il tessuto coda in due metà lungo la linea mediana; eseguire un movimento oscillante gentile con un ago. Assicurarsi che il tubo neurale, notocorda, e il tessuto PSM sono equamente divisi tra le due espianti. Pipettare ogni controlaterale espianto PSM sulla parte inferiore di un coperchio piatto cultura plastica 35 mm in un piccolo volume di pre-riscaldato (37 ° C) di coltura (DMEM-F12 + 0,1% di L-glutammina sostituto supplementato con 10% di siero fetale bovino , 10 nM bFGF umano, e l'1% di penicillina / streptomicina). <li> Posizionare il piatto sulla parte superiore del coperchio e rapidamente invertire in modo che il tessuto PSM è sospeso dal coperchio in una "goccia appeso" del mezzo. Cultura espianti PSM in una camera umidificata a 37 ° C per 1 – 2 h. paia di trasferimento di espianti PSM ai singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti. Incubare in 4% paraformaldeide in PBS per 1 ora a temperatura ambiente (RT) o 4 ° C overnight (O / N). ATTENZIONE: Paraformaldeide è tossico, e deve essere preso adeguate misure di sicurezza quando si lavora con questa soluzione. NOTA: Eseguire tutte le successive di lavaggio e di incubazione passi in una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti. Lavare i pozzetti del campione in PBS a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante, con un bel pipetta di plastica Pasteur di scambiare la soluzione PBS sui campioni di PBS fresco 3 – 4 volte. Elaborare un espianto PSM da ciascuna coppia mediante immunoistochimica (fase 2) e l'altra con ibridazione in situ fluorescente per un gene orologio noto (vep 3). 2. L'immunoistochimica di PSM espianti Lavare un espianto PSM da ciascuna coppia embrionale generato nel passaggio 1 in 2% Triton X-100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante, e quindi risciacquare campioni brevemente in PBS. Sostituire il PBS sui campioni con soluzione bloccante (albumina 2% di siero bovino (BSA) e 10% siero normale di capra (NGS) in PBS + 0,1% Tween-20) e incubare O / N a 4 ° C su una piattaforma oscillante. NOTA: Tutti i lavaggi successivi e le fasi di incubazione di questa sezione devono essere eseguite a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante, se non diversamente indicato. soluzioni di lavaggio possono essere facilmente modificati utilizzando una plastica o vetro pipetta Pasteur a punta fine. Diluire le primarie anticorpi / anticorpi desiderati in tampone di lavoro (0,1% BSA, 0,3% NGS, e 0,2% Triton X-100 in PBS). In questo esempio, diluire gli anticorpi DLL1 e Notch1 1:25 in tampone di lavoro. NOTA: L'ottimizzazione sarà richiesto per determinare il fattore di diluizione appropriata richiesta in this passaggio se si utilizzano anticorpi alternativi. Incubare espianti nella soluzione di anticorpi per 3 – 5 giorni a 4 ° C su una piattaforma oscillante. Assicurati di includere alcuni campioni con tampone di lavoro che non contengono l'anticorpo primario di agire come controlli anticorpo secondario. Recupero soluzione di anticorpo primario in un tubo memoria 1,5 mL con una pipetta e conservarlo a 4 ° C. NOTA: Recuperato anticorpo primario può essere utilizzato più volte, a seconda del anticorpo utilizzato. Eseguire 2 lavaggi dei campioni per 5 – 10 minuti ciascuno in PBS, seguito da 3 lavaggi per 10 minuti ciascuno in 2% Triton X-100 in PBS a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. Diluire fluorescente anticorpi / anticorpi secondari (epitopo-abbinato per l'anticorpo primario / anticorpi utilizzati) in tampone di lavoro. Facoltativamente, aggiungere 20 mg / ml Hoechst 33342 per questa soluzione per colorazione di contrasto nuclei. NOTA: L'ottimizzazione può essere richiesto per determinare il fattore di diluizione appropriata necessaria in questa fase. In questo example, un fattore di diluizione di 1: 400 è stato usato tipicamente. Centrifugare la soluzione di anticorpo secondario per 10 min a 16 xg per impedire la formazione di aggregati di anticorpi. Aggiungere 250 – 500 microlitri della soluzione di anticorpo secondario a ciascun pozzetto, facendo attenzione a non utilizzare gli ultimi microlitri della soluzione, che può contenere aggregati anticorpali. Coprire il piatto del campione con carta stagnola per minimizzare l'esposizione alla luce e incubare i campioni in soluzione di anticorpo secondario 3 – 5 giorni a 4 ° C al buio. Prima di assaggiare il montaggio, lavare i campioni due volte per 10 minuti ciascuno in 0,1% Tween-20 in PBS (PBST) e una volta per 5 min in PBS a RT su una piattaforma oscillante (vedi punto 4). 3. ibridazione in situ fluorescente (FISH) di PSM espianti Se conservato in un vaso alternativa, trasferire i restanti espianti PSM controlaterale ai singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti. Lavare i campioni per10 min in etanolo al 50% in PBST e quindi eseguire 2 lavaggi per 10 min ciascuna in 100% di etanolo su una piattaforma oscillante a RT per disidratare il tessuto. NOTA: Tutti i lavaggi successivi e le fasi di incubazione di questa sezione devono essere eseguite a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante, se non diversamente indicato. Reidratare il tessuto da lavaggio per 10 minuti in etanolo al 50% in PBST, seguita da lavaggio due volte per 5 minuti ciascuno in PBST. NOTA: i passaggi 3.2 e 3.3 sono necessari passaggi di fissaggio necessari per questo protocollo e non può essere omesso. Incubare i campioni con 10 mg / ml proteinasi K in 0.1% Tween-20 in PBS (PBST) per 5 minuti senza agitazione. rimuovere rapidamente la proteinasi K e sciacquare i campioni brevemente con PBST prima del post-fissare il tessuto per 30 min a 4% di formaldeide + 0,1% glutaraldeide in PBST. ATTENZIONE: Sia formaldeide e glutaraldeide sono tossici, e devono essere adottate misure di sicurezza appropriate quando si lavora con queste soluzioni. NOTA: La seguente lavaggioe le fasi di incubazione che coinvolgono il 50% e il 100% miscele di ibridazione (passi 3,6-3,9) devono essere eseguiti senza agitazione. Dopo aver lavato i campioni due volte per 10 minuti ciascuno in PBST, lavare i campioni una volta nella miscela di ibridazione 50% (adatto per le sonde intronic: 50% formammide, 5x salina-citrato di sodio (SSC), 5 mM EDTA, 50 mg / ml tRNA, 0.2% Tween-20, 0,1% SDS, e 100 mg / ml di eparina) in PBST preparati a RT. Incubare i campioni in questa soluzione per 10 min a 65 ° C senza agitazione. Risciacquare i campioni due volte con pre-riscaldato (65 ° C) della miscela di ibridazione prima incubando i campioni in miscela di ibridazione per ≥ 2 h (fino a 48 ore) a 65 ° C (tempi di incubazione più lunghi migliorare il conseguente contrasto segnale-rumore) . Rimuovere la miscela di ibridazione dal passaggio precedente, e sostituirlo a 0,25 – 0,5 di pre-riscaldato (65 ° C) della miscela di ibridazione contenente un digossigenina (DIG) -labeled sonda RNA antisenso contro un noto componente orologio segmentazione. NONE: Per esempio, una frangia Lunatic intronic (Lfng (i)) sonda è stato utilizzato ad una concentrazione di 20 microlitri / ml per rilevare nascente Lfng mRNA. La diluizione utilizzata in questo step è probe-dipendente e richiederà ottimizzazione. Sigillare la piastra con nastro adesivo per evitare l'evaporazione e incubare i campioni nella soluzione della sonda per due notti a 65 ° C. Usando una pipetta Pasteur di plastica a punta fine, recuperare la sonda per il riutilizzo e conservarlo a 20 ° C. Risciacquare i campioni due volte con pre-riscaldato (65 ° C) post-ibridazione mix (50% formammide, 0.2% Tween-20, e 1x SSC) prima di lavare i campioni altre due volte per 20 minuti ciascuno a 65 ° C in pre- riscaldato mix post-ibridazione. Lavare i campioni per 15 min a 65 ° C in miscela di ibridazione preriscaldata 50% in 0.1% Tween-20 in soluzione salina tamponata con Tris (TBST). Risciacquare i campioni due volte con TBST prima di lavare per 30 minuti a RT in TBST su una piattaforma oscillante. Pre-incubare gli espianti in blosoluzione cking (TBST + 2% tampone bloccante reagente (BBR) + 20% siero di capra trattato termicamente) per almeno 2 h. Sostituire questa soluzione con la soluzione bloccante fresco contenente una diluizione 1: 200 di perossidasi di rafano (HRP) coniugata anticorpo anti-digossigenina. Incubare i campioni O / N a 4 ° C. Dopo l'incubazione dell'anticorpo, lavare i campioni 3 volte con TBST a RT e trasferirli a singoli pozzetti di una nuova piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti. Lavare gli espianti con TBST 3 volte per 1 ora ciascuno. A questo punto, trasferire i campioni in 0,5 mL tubi memorizzazione oi singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti per ridurre il volume di reagenti di rivelazione Tyramide amplificazione del segnale (TSA) nelle seguenti fasi. Incubare campioni nel buffer di amplificazione TSA (vedi elenco reagenti) a temperatura ambiente per 1 min senza agitazione usando come piccolo volume possibile, assicurando che i campioni sono completamente immersi nella soluzione. Aggiungere TSA reagente (vedere laLista reagenti) al buffer di amplificazione campione ad una diluizione 1:50. mescolare rapidamente la soluzione fino a quando il reagente TSA è uniformemente distribuita, coprire la piastra o tubi in carta stagnola, e incubare i campioni per 60 – 90 minuti al buio. Rimuovere la soluzione di amplificazione TSA e lavare i campioni in TBST 3 volte per 5 minuti ciascuno. Trasferire gli espianti di nuovo ad una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti per aumentare il volume di lavaggio e incubare i campioni in perossido di idrogeno 1% in TBST per 1 h. Lavare i campioni con TBST 3 volte per 5 minuti ciascuno, e poi due volte per 5 minuti ciascuno con PBST prima di assaggiare il montaggio (vedi punto 4). 4. Preparazione del campione per l'imaging Preparare una carica vetrino adesione per ogni coppia espianto aggiungendo 0,12 mm distanziatori di imaging di spessore, che impediscono i campioni possano essere intrappolati con l'aggiunta di un coprioggetto. Rimuovere il rivestimento adesivo da una superficie di un distanziatore e posizionarlo adesivo rivolto verso il basso su un vetrino, premendo firmly per sigillare il distanziatore alla diapositiva. NOTA: per i passaggi rimanenti, il possibile per mantenere i campioni in condizioni di scarsa luce o al buio per evitare photobleaching. Pipette coppie espianto su un vetrino preparato con un bicchiere pipetta Pasteur all'interno del centro del distanziatore, assicurando che il lato sezionato del espianto affronta la diapositiva. Disporre coppie controlaterale del lato espianti a fianco. Rimuovere quanto più liquido possibile dal vetrino con un bicchiere pipetta Pasteur e Wick l'eventuale umidità residua che circonda i campioni utilizzando un pezzo di carta velina basso rilascio di fibre piegato. Permettere ai campioni di aderire alla diapositiva per 45 – 60 s, finché il tessuto inizia a comparire appiccicoso e trasparente. Durante questo tempo, togliere il rivestimento adesivo restante dal distanziale con pinze. Non lasciare che i campioni si asciughino. Aggiungere una grande goccia di doppia funzione montante e la soluzione di compensazione (0,5% p-fenilendiammina e 20 mM Tris, pH 8,8, 90% glicerolo) ai campioni all'interno del centrodel distanziale. NOTA: Questa soluzione diventa marrone / nero quando consentito per ossidare. Posizionare con cura un coprioggetto circolare (n. 1.5) attraverso i campioni, in modo che il mezzo di montaggio è distribuito uniformemente e che tutti i bordi del vetrino entrare in contatto con il distanziatore. Posizionare il vetrino di copertura-scivolato a testa in giù su un foglio di carta velina basso rilascio di fibre. Premere con forza per garantire che il coprioggetto aderisce completamente al distanziatore e che ogni montante eccesso viene rimosso. Ripetere fino a quando non le macchie più montante della carta. Pulire ed etichettare la slitta (s) in modo appropriato, e memorizzarli al buio fino a immagini, a breve termine a -20 ° C oa lungo termine a -80 ° C. Dopo aver rimosso le diapositive dalla memoria, permettere loro di scongelare completamente prima di imaging. Immagine campioni montati utilizzando un microscopio confocale con l'acquisizione in maiolica e un obiettivo di alto ingrandimento. Immagine le coppie di espianti con un obiettivo ad immersione 40X a Z-intervalli di 4 micron utilizzando 488 nm, 568 nm e 647 nm laser lines per eccitare i fluorofori verde, rosso e rosso lontano, rispettivamente impiegati per le proteine e la rilevazione di mRNA in questo studio 12. NOTA: Piastrellati immagini sono state cucite post-acquisizione in modo da formare una singola immagine per l'analisi. 5. post-acquisizione Image Analysis Utilizzare immagine software di analisi per definire una regione di interesse all'interno del PSM di ciascun campione sperimentale. Per quantificare i livelli di espressione, sfondo sottrattivo e immagini soglia al livello di un campione di controllo non-primario prima successiva quantificazione. Definire un'origine, un asse, ed una unità di lunghezza per ogni campione. Calcolare l'intensità di fluorescenza in funzione della posizione lungo l'asse rostro-caudale normalizzato per ciascuna delle M campioni 12. Dopo normalizzare le trame intensità, posizionare il lato profili di intensità all'altra e formare una matrice di intensità f (i, j) che descrive l'intensità al i <sup> ° posizione spaziale nel j-esimo del campione. 6. ordinamento temporale dei campioni Per dedurre ordinamento temporale di un componente orologio noto, definire la matrice di intensità. Poi, riordinare le colonne della matrice intensità in modo da ottenere un modello temporalmente periodica. A tale scopo, definire la funzione dove A (f j; k) rappresenta la funzione di autocorrelazione del j esima colonna di f e A T è una funzione target autocorrelazione, scelti per applicare la periodicità temporale del modello, in Utilizzare il Metropolis-Hastings (o un altro algoritmo di minimizzazione) 12 per identificare l'ordine dei campioni che minimizzano la funzione g. Così, determinare l'ordine delM campioni che massimizza la periodicità temporale di una componente di orologio noto. Utilizzando l'ordinamento temporale dedotto di campioni M, costruire un chimografo ordinato per il modello di espressione nel canale partnered 12.