סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות
Summary
The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.
Abstract
During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the “segmentation clock,” acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as “kymographs,” for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.
Introduction
Somites הם הקטעים הראשונים נוצרו ציר הגוף מתארך בפיתוח בעלי חוליות והם המבשרים של עמוד השדרה, צלעות, ורקמות הדרמיס, כמו גם של שריר ותאי האנדותל. במהלך somitogenesis, somites אפיתל יוצרים מן mesoderm presomitic unsegmented (PSM) (הנסקרת ב Reference 1). תהליך זה מוסדר על ידי "שעון הפילוח," אשר מורכב מרשת של גנים וחלבונים תנודתית, בעיקר מקרבים את מסלול איתות Notch. שעון הפילוח מורכב לולאות משוב שליליות שונות, אשר מאפשרות ייצור pulsatile פעילות Notch בתוך תא בודד 2 (הנסקרת ב הפניות 3 – 6). בעוד השיטה של תנודת תאיים מאופיינת היטב, הוא עדיין ברובו לא ידוע כיצד תנודות אלה מתואמים על פני רקמת PSM. הוכח לאחרונה, באמצעות שני מחקרים ניסיוניים ותיאורטיים, כי תנודות אלה הם essential לתהליך somitogenesis וכי מסלול Notch ממלא תפקיד מכריע בתהליך של שני פילוח ביטוי גנים תנודתית 7, 8. עם זאת, זה כבר דווח בהרחבה כי Notch קולטן 1 (Notch1) ודלתא דמוי ליגנד (DLL) -1 יש הדרגתיים הסטטי PSM 9, 10, 11.
החוקרים שיערו כי תנודות תלויי Notch של השעון פילוח PSM תלוי הפעלה תקופתית של הקולטן ליגנד מסלול Notch הראשי, Notch1 ו Dll1, בהתאמה, על פני PSM העכבר. המסקנות של מחקרים קודמים שדיווחו על שיפוע מקורי, זנב סטטי של החלבונים האלה נבעו, אנו צופים, חוסר הרגישות בטכניקות immunostaining. הם ולכן לא יכלו לזהות תנודות ברמה הנמוכה של Dll1 ו Notch1 ב PSM הזנב.
אנחנו havדואר המציא שיטה יותר מקרוב הגורמים הללו, שילוב נתוני ניסוי עם מודלים מתמטיים כדי לחזות מנגנון שבאמצעותו התנודות של החלבונים של רכיבי שעון מתואמים ברחבי PSM 12.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לזהות ולכמת ברמה נמוכה, ביטוי חלבון דינמי PSM ולמפות את פרופילי הביטוי של חלבונים בעלי עניין על פי הביטוי של הגן השעון הידוע, השוליים הסהרוריים (Lfng). מאז מחזור אחד של השעון פילוח בעובר העכבר לוקח 2 שעות כדי להשלים, דגימות שונות נדרשים לבנות פרופיל spatiotemporal ביטוי מוחלט חלבון Dll1 ו Notch1 במהלך תנודה אחת Lfng ב PSM. אנחנו ובכך פתחנו בפרוטוקול זה כדי לאפשר זיהוי תפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ברמה הנמוכה כל ההר, explants PSM הנגדי. עם זאת, הטכניקה הזו גם יכולה להיות שימושית עבור t מחקריםכובע שואף לאפיין דינמיקת חלבון ברמה הנמוכה בתוך כל רקמה עוברית כי ניתן לפצל לשני חצאים נגדיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה רגישה לבצע ניתוח כמותי של דינמיקת ביטוי חלבון ברמה הנמוכה תנודתית ב explants E10.5 עכבר PSM. פרוטוקול חזק עבור שני אימונוהיסטוכימיה ניאון הכלאה באתרו (FISH) ואחריו ברזולוציה גבוהה כל הר הדמית confocal, ולאחר מכן על ידי ניתוח תמונה ופילוח זמני של kymographs ליצור מפת spatiotemporal של ביטוי חלבון פני PSM. יחס אות לרעש גבוה זיהוי חלבוני mRNA הוא חיוני כדי להבטיח את הצלחת של טכניקה זו. יש להקפיד להחליף את כל הפתרונים ביסודיות וביעילות במהלך השלבים לשטוף וכדי לשמור על הטמפרטורה של 65 מעלות שוטף C בשלבים הרלוונטיים של שלב 3. זה כדאי ביותר לקחת את הזמן למקור נוגדנים יעילים ו בדיקות RNA נגד מטרות של עניין ועל מנת לבדוק ריאגנטים אלה ביסודיות על דגימות כל הר לפני תחילת בפרוטוקול זה.
שינויים ופתרון בעיות
בין הנושאים העיקריים שעשויים להיות נתקל בעת ביצוע בפרוטוקול זה להתעורר מחיל ואיכות זיהוי אות עניים. זו תלויה במידה רבה על היעילות של נוגדנים או בדיקות RNA המשמש את הצעדים אימונוהיסטוכימיה או FISH בפרוטוקול, בהתאמה. מספר צעדים שונים עשויים לדרוש אופטימיזציה לפני מושגת זיהוי קליטה מתאימה. אחת סיבות נפוצות לגילוי אות מסכן היא קיבעון פסול; זוהי חובתו או PFA או PFA הטריים מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע משמש כדי לתקן את הדגימות. אורכו של קיבעון יכול גם לדרוש אופטימיזציה, תלוי חללית הנוגדן או RNA בשימוש. עבור נוגדנים, מומלץ לעקוב אחר ההוראות של היצרן במידת האפשר, ואילו עבור בדיקות RNA, אנו מייעצים התייעצות של הספרות שפורסם.
<p class = "jove_content"> במחקר זה, השתמשנו בדיקה רנ"א במיוחד מזהה את הרנ"א הראשוני של גן השעון Lfng. בשל חוסר השפע היחסי, זיהוי של mRNA טרום Lfng מצריך תקופה ארוכה של דגירה עם החללית בתמהיל כלאה המכיל ציטראט מלוח-נתרן 5x (SSC) לגילוי אות טוב. אותם התנאים עשויים לחול על בדיקות אחרות מאתרות mRNAs הביע בחולשה, אבל מניסיוננו, זיהוי של מטרות mRNA יציבות יותר עשוי לדרוש צעד הכלאת בדיקה קצר יותר וריכוזי SSC נמוכים בתמהיל ההכלאה (למשל, SSC 1.3x). עבור שתי אימונוהיסטוכימיה ודגים, הפרוטוקול חייב להיות מותאם ראשון על עובר כולו, ואת הריכוז האופטימלי של נוגדנים או בדיקה צריך להיקבע באופן אמפירי.מגבלות של הטכניקה
כאמור, ההצלחה של טכניקה זו תלויה במידה רבה על איכות החלבון וזיהוי mRNA. Wדואר התווה כמה הצעות איך חלבון וזיהוי mRNA ניתן לשפר, אבל בהיעדר זיהוי אות ניאון באיכות גבוהה, אין דרך הניסוי יכול להמשיך. מספר מטרות חלבון כי ניתן לנתח בכל דגימת רקמה הוא מוגבל על ידי הרזולוציה ספקטרלית של המיקרוסקופ confocal ועל ידי אפיטופים של הנוגדנים בשימוש. במחקר זה, הצלחנו להשתמש עד שלושה אפיטופים לגילוי חלבון לצד כתם DNA על כל דגימה 12. פרוטוקול זה רק מאפשר זיהוי של יעד אחד mRNA, למרות שיטות חלופיות נוכחיות יכולות להיות מועסקות על מנת להגדיל את זה ל עד שלוש מטרות 14.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
השיטה המתוארת כאן מספקת טכניקה רגישה לזהות תנודות חלבון ברמה נמוכה כל הר explants PSM. כימות של דינמיקה אלה היאניתן על ידי ביצוע FISH עבור גן שעון ידוע מקביל explants הנגדי. ספריה של kymographs נוצרת כי ניתן לארגן על מחזור שעון פילוח אחד, המדגיש את הדינמיקה ביטוי spatiotemporal של יעד של עניין בתוך מסגרת זמן זו. הבדל מפתח בטכניקה זו על פני אחרים הוא עושה שימוש רב באוטומציה חישובית להורות ערכות נתונים גדולות ובזמן, המתירה את דינמיקת ביטוי spatiotemporal של רכיבי שעון רומן להיות מנותחת משוא פנים. לדוגמה, טכניקה זו סיפק תובנות לגבי האופן שבו חלבונים Dll1 ו Notch1 תנודות שלהם הם שיתוף מוסדר ברחבי PSM כולו. שיטות חלופיות בהקשר זה גם יש לסמוך על immunostaining, אבל הם לא לזהות את תנודות קטנות ברמות חלבון Dll1 ו Notch1 ב PSM הזנב כי ניכרו באמצעות שיטה זו. במקום זאת, הם דיווחו על שיפוע יציב של ביטוי כי הוא חזק ביותר באזור המקורי 9 <sעד>, 10, 11. זה יכול להיות בשל העובדה כי פרוטוקול זה יש תקופת הדגירה נוגדן ראשוני ממושכים (3 – 5 ימים, להבדיל בין לילה), אשר עשויים להידרש לזהות רמות נמוכות של חלבון. כמו הרמות של Dll1 וביטוי Notch1 יחסית גבוהות המקורי PSM, זה עשוי להשפיע על המחברים לתדמית הדגימות ב חשיפה נמוכה הגדרה יותר תהיינה צורך לזהות את ביטוי חלבון הזנב. אחת להיבדל פוטנציאל נוסף העולה מן השימוש ברקמה מבולבלת במחקר ידי אל צ'פמן et. , שבו ביטוי המעבר של Dll1 ו Notch1 ב PSM הזנב ייתכן השתמרו היטב 9 פחות.
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג הטכניקה
לאחר פרוטוקול זה כבר שולט, ניתוח ביטוי תפוקה גבוהה יכול להתבצע עבור כל חלבון של עניין PSM.explants PSM המופק המלטות עכבר כמה יכול להיות מעובד בו זמנית כדי ליצור את מספר הדגימה הגבוהה הדרושים לניתוח. למרות שאנו רק השתמשנו עוברות wild-type במחקרים אלה, ניתן לבצע ניתוח זה באמצעות עוברים מהונדסים גנטי על מנת להעריך את החשיבות של גורמים אחד או יותר על דינמיקת ביטוי חלבון. מעבר PSM, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למערכות אחרות שבן מורכבים משני חצי נגדיים ויכול לשמש כדי לזהות ברגישות דינמיקת ביטוי חלבון ברמה הנמוכה תנודתית. אחת הדוגמאות עבורו פרוטוקול זה יכול להיות מותאם היא חקר ביטוי חלבון דינמי בצינור העצבי העכבר, מאז חצאים הנגדי יכול להיווצר ותרבותי, ופעילות Notch הוכח להיות גם בהווה חשוב patterning 15. אנו מעודדים קבוצות אחרות כדי להתאים את הפרוטוקול למערכות אחרות וכדי לספק משוב לשיפור בעתיד.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת הלימודים MRC כדי RAB, גידול מלגת הלימודים MRC כדי CSLB, ומענק פרויקט WT כדי JKD (WT089357MA). העבודה נתמכה גם על ידי פרס אסטרטגי Trust ברוך (097,945 / Z / 11 / Z). אנו מודים לד"ר א Kremmer על מתנת סוג של נוגדן Dll1 וד"ר O. Pourquie עבור בדיקת RNA Lfng.
Materials
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100X) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *NOTE: The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), 625-639 (2012).
- Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), 2783-2792 (2011).
- Dequéant, M. -. L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).
- Bailey, C., Dale, K. . Somitogenesis in Vertebrate Development. , 1-15 (2015).
- Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), 2453-2456 (2012).
- Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
- Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).
- Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842 (2015).
- Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
- Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141 (2012).
- Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), 4806-4816 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).
- Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
- Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), 2291-2303 (2015).
