Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps
Summary
The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.
Abstract
During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the “segmentation clock,” acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as “kymographs,” for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.
Introduction
Somiten sind die ersten in den Verlängerungskörperachse gebildet Segmente in Vertebratenspezies entwickelt und sind die Vorläufer der Wirbelsäule, Rippen und Dermis Gewebe sowie Muskel- und Endothelzellen. Während Somitogenese bilden epithelialen Somiten vom unsegmented präsomitischen Mesoderm (PSM) (beschrieben in Referenz 1). Dieser Prozess wird durch die "Segmentation Uhr" geregelt, die aus einem Netzwerk von oszillatorischen Genen und Proteinen besteht, meist an den Notch-Signalweg gehören. Die Segmentierung Uhr besteht aus verschiedenen negativen Rückkopplungsschleifen, die die pulsatile Produktion von Notch – Aktivität innerhalb einer einzelnen Zelle 2 ( beschrieben in Referenzen 3 – 6) , ermöglichen. Während die intrazelluläre Methode Schwingungs gut charakterisiert ist, ist es immer noch weitgehend unbekannt, wie diese Schwingungen über das PSM Gewebe abgestimmt sind. Es wurde kürzlich gezeigt, durch beide experimentelle und theoretische Untersuchungen, dass diese Schwingungen essentia sindl für den Prozess der Somitogenese und dass der Notch – Signalweg spielt eine wichtige Rolle im Prozess der Segmentierung und sowohl oszillierende Genexpression 7, 8. Jedoch wurde es allgemein , dass Notch – Rezeptor 1 (Notch1) berichteten , und Delta-like – Ligand (Dll) -1 haben statische Gradienten in der PSM 9, 10, 11.
Wir vermuten, dass Notch abhängigen Schwingungen der PSM Segmentierung Uhr hängen von der periodischen Aktivierung des Haupt Notch-Signalweg Rezeptor und Ligand, Notch1 und DLL1 jeweils über die Maus PSM. Die Schlussfolgerungen aus früheren Studien, die eine statische rostral-kaudale Gradienten dieser Proteine berichtet wurden, waren wegen, wir vorhersagen, zu einem Mangel an Sensibilität in Immunfärbungstechniken. Sie waren daher nicht in der Lage mit niedrigem Pegelschwankungen von DLL1 und Notch1 im kaudalen PSM zu erkennen.
Wir have entwickelte ein Verfahren , um mehr genau prüfen , diese Faktoren, experimentelle Daten mit mathematischen Modellen kombiniert , mit dem ein Mechanismus zur Vorhersage der Schwingungen der Proteine von Taktkomponenten über die PSM 12 koordiniert werden.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist , Low-Level, dynamische Protein – Expression im PSM nachzuweisen und zu quantifizieren und die Expressionsprofile von Proteinen von Interesse zur Karte nach dem Ausdruck des bekannten Uhr – Gen, lunatic fringe (Lfng). Da ein Zyklus des Segmentierungs Uhr im Mausembryo 2 h dauert, werden verschiedene Proben erforderlich , um eine vollständige Raum – Zeit – Profil der DLL1 und Notch1 Protein – Expression während einer Lfng Oszillation in der PSM zu bauen. Damit haben wir dieses Protokoll zu ermöglichen, für die Hochdurchsatz-Nachweis von Low-Level-Proteinexpression in ganz-mount, kontralateralen PSM Explantate entwickelt. Allerdings kann diese Technik auch nützlich sein für Studien tHut Ziel Low-Level-Proteindynamik innerhalb eines embryonalem Gewebe zu charakterisieren, die in kontralateralen Hälften geteilt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein empfindliches Verfahren die quantitative Analyse von Low-Level-Proteinexpression und Schwingungsdynamik in E10.5 Maus PSM Explantate auszuführen. Ein robustes Protokoll sowohl für die Immunhistochemie und Fluoreszenz – in – situ – Hybridisierung (FISH) wird durch hochauflösende Vollmontage konfokale Abbildung gefolgt, und dann durch Bildanalyse und zeitliche Segmentierung von Kymographen eine Raum – Zeit – Karte von Protein – Expression über die PSM zu erzeugen. Ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis in Protein- und mRNA-Nachweis ist von wesentlicher Bedeutung für den Erfolg dieser Technik zu gewährleisten. Es muss sorgfältig getroffen werden, um alle Lösungen effektiv während der Waschschritte auszutauschen und die Temperatur der 65 ° C Waschungen in den entsprechenden Stufen der Schritt zu halten 3. Am günstigsten ist es, die Zeit zu nehmen wirksame Antikörper und RNA-Sonden gegen die Source- Ziele von Interesse und diese Reagenzien zu testengründlich auf ganze-mount Proben vor, dieses Protokoll zu starten.
Technische Änderungen und Fehlerbehebung
Die wichtigsten Probleme, die auftreten können, wenn dieses Protokoll Durchführung ergeben sich aus schlechten Signalerkennung Stärke und Qualität. Dies ist weitgehend abhängig von der Wirksamkeit der verwendeten Antikörper oder RNA-Sonden für die Immunhistochemie oder FISH Schritte in dem Protokoll, respectively. Eine Anzahl von verschiedenen Schritte können Optimierungs erfordern, bevor eine ausreichende Signalerfassung erreicht wird. Eine häufige Ursache für schlechte Signalerkennung ist unsachgemäße Fixierung; es ist zwingend notwendig, dass entweder frisch PFA oder PFA für nicht mehr als eine Woche bei 4 ° C gelagert wird verwendet, um die Proben zu beheben. Die Länge der Fixierung kann auch eine Optimierung erfordern, abhängig von der Antikörper oder RNA-Sonde verwendet. Für Antikörper, ist es ratsam, den Anweisungen des Herstellers, wo möglich, während für die RNA-Sonden zu folgen, wir die Anhörung der veröffentlichten Literatur zu beraten.
<p class = "jove_content"> In dieser Studie verwendeten wir eine RNA – Sonde, die die prä-mRNA des Takt Gen Lfng spezifisch erkennt. Aufgrund seiner relativen Mangel an Fülle, Erkennung von Lfng pre-mRNA erfordert eine lange Zeit der Inkubation mit der Sonde in Hybridisierungsmischung 5x Saline-Natriumcitrat (SSC) für eine gute Signalerkennung enthält. Dieselben Bedingungen können auf andere Sonden anwenden , die schwach exprimierten mRNAs erkennen, aber in unserer Erfahrung, die Detektion von stabiler mRNA – Ziele kann eine kürzere Sondenhybridisierungsschritt und unteren SSC – Konzentrationen in der Hybridisierungsmischung (beispielsweise 1,3x SSC) erfordern. Für beide Immunhistochemie und FISH, muss das Protokoll zunächst auf ganze Embryonen optimiert werden, und die optimale Konzentration der Antikörper oder Sonde muss empirisch ermittelt werden.Einschränkungen der Technik
Wie oben erwähnt, ist der Erfolg dieser Technik stark abhängig von der Qualität des Proteins und der mRNA-Detektion. We wurden mehrere Vorschläge dargelegt, wie Protein- und mRNA-Nachweis kann verbessert werden, aber in Abwesenheit von hochwertigen Fluoreszenzsignalerfassung, gibt es keine Möglichkeit der Versuch fortgesetzt werden kann. Die Anzahl der Protein-Targets, die in jeder Gewebeprobe analysiert werden können, wird durch die spektrale Auflösung des konfokalen Mikroskops und durch die Epitope der verwendeten Antikörper beschränkt. In dieser Studie konnten wir auf drei Epitope für Proteindetektion neben einer DNA – Fleck auf jeder Probe 12 verbrauchen. Dieses Protokoll erlaubt nur die Erfassung einer mRNA Ziel, obwohl Strom alternative Verfahren verwendet werden könnten , 14 diese auf bis zu drei Ziele zu erhöhen.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
Das hier beschriebene Verfahren stellt eine empfindliche Technik Low-Level-Protein Schwankungen ganz-mount PSM Explantate zu erkennen. Die Quantifizierung dieser Dynamik istmöglich durch in entsprechenden kontralateralen Explantate FISH für ein bekanntes Uhr-Gen durchgeführt wird. Eine Bibliothek von Kymographen generiert, organisiert über Zyklus eine Segmentierung Uhr werden kann, Hervorhebung der Raum-Zeit-Ausdruck Dynamik ein Ziel von Interesse innerhalb dieses Zeitrahmens. Ein wesentlicher Unterschied in dieser Technik gegenüber anderen ist die Verwendung von Rechen Automatisierung zeitlich große Datenmengen zu bestellen, die die räumlich-zeitliche Dynamik Ausdruck neuer Taktkomponenten ermöglicht in unvoreingenommen analysiert werden. Beispielsweise kann diese Technik bereitgestellt Einblick, wie DLL1 und Notch1 Proteine und ihre Schwingungen über die gesamte PSM co-reguliert. Alternative Methoden in diesem Zusammenhang auch auf die Immunfärbung verlassen, aber sie haben die kleinen Schwankungen in DLL1 und Notch1 Proteinspiegel in der Schwanz PSM nicht erkennen, die offensichtlich mit dieser Methode waren. Stattdessen berichtet sie einen stetigen Steigung des Ausdrucks , die am stärksten in der rostralen Region 9 <snach oben>, 10, 11. Dies könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass dieses Protokoll eine längere primäre Antikörper Inkubationszeit (3 – 5 Tage, im Gegensatz zu über Nacht), die erforderlich sein können geringere Mengen an Protein zu detektieren. Da die Ebenen von DLL1 und Notch1 Ausdruck relativ hoch im rostralen PSM sind, haben diese können die Proben, die die Autoren Bild beeinflusst bei einer niedrigeren Belichtungseinstellung als wäre notwendig, um die Schwanzproteinexpression zu erkennen. Ein weiteres Potential Diskrepanz ergibt sich aus der Verwendung von nicht – fixierten Gewebe in der Studie von Chapman et al. In denen die vorübergehende Expression von DLL1 und Notch1 in der Schwanz PSM weniger sein können 9 gut erhalten.
Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach der Technik Mastering
Sobald dieses Protokoll, Hochdurchsatz-Expressionsanalyse beherrscht wurde für jedes Protein von Interesse in der PSM durchgeführt werden.PSM Explantate aus mehreren Maus Würfen erzeugt wird, kann auf einmal verarbeitet werden, um die hohe Probennummer, die zur Analyse zu erzeugen. Obwohl wir nur Wildtyp-Embryonen in diesen Studien verwendet wurden, ist es möglich, diese Analyse durchzuführen unter Verwendung von gentechnisch veränderten Embryonen, um die Bedeutung eines oder mehrerer Faktoren auf die Proteinexpression Dynamik zu bewerten. Jenseits der PSM kann dieses Protokoll auf andere Systeme angepaßt werden, die aus zwei Hälften zusammengesetzt sind kontralateralen und verwendet werden können, empfindlich auf niedriger Ebene Proteinexpression und Schwingungsdynamik zu erfassen. Ein Beispiel für die dieses Protokoll angepasst werden könnte , ist die Untersuchung der dynamischen Protein – Expression in der Maus Neuralrohr, da kontralateralen Hälften erzeugt werden könnten und kultiviert und Notch – Aktivität wurde sowohl anwesend sein und wichtige gezeigt 15 zum Mustern. Wir ermutigen andere Gruppen dieses Protokoll auf andere Systeme anzupassen und für künftige Verbesserungen, Feedback zu geben.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem MRC studentship RAB unterstützt, ein MRC studentship zu CSLB und einem WT Projektförderung zu JKD (WT089357MA). Die Arbeit wurde auch durch ein Wellcome Trust Strategic Auszeichnung (097.945 / Z / 11 / Z) unterstützt. Wir danken Dr. E. Kremmer für die Art Gabe des DLL1 Antikörper und Dr. O. Pourquié für die Lfng RNA – Sonde.
Materials
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100X) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *NOTE: The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
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