الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط
Summary
The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.
Abstract
During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the “segmentation clock,” acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as “kymographs,” for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.
Introduction
القطع البدنية النمطية هي أول القطاعات التي تشكلت في التطويل محور الجسم في تطوير أنواع الفقاريات وهي السلائف في العمود الفقري، الأضلاع، والأدمة الأنسجة، وكذلك العضلات والخلايا البطانية. أثناء تكون الجسيدات، تشكل القطع البدنية النمطية الظهارية من الأديم المتوسط unsegmented presomitic (PSM) (إعادة النظر في المرجع 1). وينظم هذه العملية من خلال "ساعة تجزئة"، والذي يتكون من شبكة من الجينات متذبذبة والبروتينات، ومعظمهم ينتمون إلى مسار الشق الإشارات. وتتكون الساعة تجزئة مختلف الحلقات ردود الفعل السلبية، والتي تمكن من إنتاج نابض النشاط الشق داخل خلية واحدة 2 (إعادة النظر في المراجع 3-6). في حين أن طريقة الخلايا من التذبذب يتميز كذلك، فإنه لا يزال غير معروف إلى حد كبير كيف يتم تنسيق هذه التذبذبات في جميع أنحاء الأنسجة PSM. وقد تبين في الآونة الأخيرة، سواء من خلال الدراسات التجريبية والنظرية، أن هذه التذبذبات ضروريهل لعملية تكون الجسيدات وأن مسار الشق يلعب دورا حاسما في عملية على حد سواء تجزئة والتعبير الجيني متذبذبة 7 و 8. ومع ذلك، فقد أفيد على نطاق واسع أن الشق مستقبلات 1 (Notch1) ودلتا تشبه يجند (دلل) -1 ديك التدرجات ثابتة في PSM 9 و 10 و 11.
ونحن افترضنا أن التذبذبات التي تعتمد على الشق من ساعة PSM تجزئة تعتمد على تفعيل الدوري لمستقبلات الرئيسي الشق مسار ويجند، Notch1 وDLL1، على التوالي، عبر PSM الماوس. وكانت نتائج الدراسات السابقة التي سجلت التدرج منقاري الذيلية ثابت من هذه البروتينات الواجبة، نتوقع، لعدم وجود حساسية في التقنيات المناعية. لذا كانوا قادر على الكشف عن التقلبات على مستوى منخفض من DLL1 وNotch1 في PSM الذيلية.
لديناوضعت البريد وسيلة لدراسة عن كثب هذه العوامل، والجمع بين البيانات التجريبية مع النماذج الرياضية للتنبؤ آلية التي يتم من خلالها تنسيق التذبذبات من البروتينات من المكونات على مدار الساعة عبر PSM 12.
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو كشف وتحديد مستوى منخفض، والتعبير البروتين الحيوي في إدارة المشتريات والتوريدات ولتعيين ملامح التعبير من البروتينات التي تهم وفقا للتعبير عن الجينات على مدار الساعة المعروفة، جماعات متطرفة مجنونة (Lfng). منذ دورة واحدة على مدار الساعة تجزئة في جنين الفأر يأخذ 2 ساعة لاستكمال، هناك حاجة عينات مختلفة لبناء الشخصية الزمانية المكانية كاملة من DLL1 وNotch1 تعبير البروتين أثناء واحدة التذبذب Lfng في إدارة المشتريات والتوريدات. وبذلك نكون قد وضعت هذا البروتوكول للسماح للكشف عن الإنتاجية العالية للتعبير البروتين على مستوى منخفض في كامل جبل، إإكسبلنتس PSM المقابل. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تكون هذه التقنية مفيدة للدراسات روتهدف قبعة لوصف ديناميات البروتين على مستوى منخفض داخل أي نوع من الأنسجة الجنينية التي يمكن تقسيمها إلى نصفين المقابل.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
يصف هذا البروتوكول طريقة حساسة لإجراء تحليل كمي لمستوى منخفض تعبير البروتين ومتذبذبة ديناميكية في إإكسبلنتس E10.5 الماوس PSM. ويتبع بروتوكول قوية لكلا المناعية والفلورية في الموقع التهجين (FISH) بواسطة عالية الدقة كله يشن التصوير متحد البؤر، ومن ثم عن طريق تحليل الصور وتجزئة الزمنية للkymographs لتوليد خريطة الزمانية المكانية للتعبير البروتين في جميع أنحاء PSM. وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء في البروتين ومرنا كشف أمر ضروري لضمان نجاح هذه التقنية. يجب الحرص على تبادل تماما عن حلول فعالة خلال خطوات غسل والحفاظ على درجة حرارة 65 ° C يغسل في المراحل ذات الصلة من الخطوة 3. هو الأكثر فائدة لتأخذ من الوقت لمصدر الأجسام المضادة فعالة وتحقيقات RNA ضد أهداف الفائدة ولاختبار هذه الكواشف تماما على عينات جبل بأكمله قبل البدء في هذا البروتوكول.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
تنشأ القضايا الرئيسية التي يمكن مواجهتها عند تنفيذ هذا البروتوكول من ضعف قوة الكشف عن إشارة والجودة. هذا يعتمد إلى حد كبير على فعالية الأجسام المضادة أو تحقيقات RNA المستخدمة لالمناعية أو FISH الخطوات في البروتوكول، على التوالي. قد تتطلب عدد من الخطوات المختلفة الأمثل قبل أن يتحقق الكشف عن إشارة كافية. أحد الأسباب الشائعة لضعف إشارة الكشف هو تثبيت غير لائق، لا بد من أن أي PFA الطازجة أو PFA تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد يستخدم لتحديد العينات. قد تتطلب طول التثبيت أيضا الأمثل، اعتمادا على الأجسام المضادة أو RNA التحقيق المستخدمة. عن الأجسام المضادة، وينصح اتباع تعليمات الشركة الصانعة حيثما كان ذلك ممكنا، في حين أن تحقيقات الجيش الملكي النيبالي، ونحن ننصح استشارة الكتابات المنشورة.
<p clasالصورة = "jove_content"> في هذه الدراسة، استخدمنا التحقيق RNA الذي يكشف على وجه التحديد ما قبل مرنا من الجينات على مدار الساعة Lfng. بسبب النقص النسبي في وفرة، والكشف عن Lfng قبل مرنا يتطلب فترة طويلة من الحضانة مع لجنة التحقيق في مزيج التهجين التي تحتوي على 5X سيترات الصوديوم المالحة (SSC) للكشف عن إشارة جيدة. قد تنطبق نفس هذه الشروط لتحقيقات الأخرى التي كشف من mRNAs أعرب ضعيفة، ولكن في تجربتنا، والكشف عن أهداف مرنا أكثر استقرارا قد يتطلب أقصر خطوة التحقيق التهجين وانخفاض تركيزات SSC في مزيج التهجين (على سبيل المثال، 1.3x SSC). لكل المناعية والأسماك، يجب أولا أن يكون الأمثل البروتوكول على الأجنة كلها، وتركيز الأمثل من الأجسام المضادة أو التحقيق يجب أن تحدد تجريبيا.القيود المفروضة على تقنية
وكما ذكر أعلاه، فإن نجاح هذه التقنية يعتمد بشكل كبير على نوعية من البروتين وكشف مرنا. Wوقد أوجز ه عدة اقتراحات بشأن الكيفية التي يمكن بها تحسين البروتين وكشف مرنا، ولكن في حالة عدم وجود كشف ذات جودة عالية إشارة فلوري، لا توجد وسيلة التجربة يمكن المضي قدما. ويقتصر عدد من الأهداف البروتين التي يمكن تحليلها في كل عينة الأنسجة بقرار الطيفي للالمجهر متحد البؤر والحواتم من الأجسام المضادة المستخدمة. في هذه الدراسة، كنا قادرين على استخدام ما يصل إلى ثلاثة الحواتم للكشف عن البروتين جنبا إلى جنب مع وصمة عار الحمض النووي في كل عينة 12. هذا البروتوكول يسمح فقط للكشف عن الهدف مرنا واحد، على الرغم من أن الطرق البديلة الحالية يمكن أن تستخدم لزيادة هذه النسبة إلى ما يصل إلى ثلاثة أهداف (14).
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
الطريقة الموصوفة هنا يوفر تقنية حساسة للكشف عن تقلبات البروتين على مستوى منخفض في إإكسبلنتس PSM-جبل بأكمله. القياس الكمي لهذه الديناميات هوممكن عن طريق أداء FISH لجين على مدار الساعة المعروفة في إإكسبلنتس المقابل المقابلة. يتم إنشاء مكتبة kymographs التي يمكن تنظيمها خلال دورة على مدار الساعة تجزئة واحدة، وتسليط الضوء على ديناميات التعبير الزمانية المكانية من هدف المصالح داخل هذا الإطار الزمني. والفرق الرئيسي في هذه التقنية مقارنة مع الآخرين هو استخدام الأتمتة الحسابي لأجل زمنيا مجموعات كبيرة من البيانات، التي تسمح للديناميات التعبير الزمانية المكانية من مكونات ساعة جديدة ليتم تحليلها بطريقة غير متحيزة. على سبيل المثال، هذه التقنية توفر نظرة ثاقبة كيف DLL1 وNotch1 البروتينات والتذبذبات هم شارك في تنظيمها عبر PSM بأكمله. وقد اعتمدت أساليب بديلة في هذا السياق أيضا على المناعية، لكنها لم يكشف عن تقلبات صغيرة في DLL1 وNotch1 مستويات البروتين في PSM الذيلية التي كانت واضحة باستخدام هذا الأسلوب. بدلا من ذلك، وذكرت أنها الانحدار مستمر من التعبير الذي هو الأقوى في المنطقة منقاري 9 <sتصل>، 10، 11. وهذا يمكن أن يكون راجعا إلى حقيقة أن هذا البروتوكول لديه الأجسام المضادة الأولية فترة أطول الحضانة (3-5 أيام، في مقابل ليلة وضحاها)، والتي قد تكون مطلوبة للكشف عن مستويات منخفضة من البروتين. وذلك لأن مستويات DLL1 والتعبير Notch1 مرتفعة نسبيا في PSM منقاري، وهذا قد أثرت على الكتاب لصورة ان عينات في أقل من التعرض تحديد من سيكون ضروريا للكشف عن بروتين تعبير الذيلية. ينشأ واحد مزيد من التناقض المحتمل من استخدام الأنسجة غير المثبتة في الدراسة التي تشابمان وآخرون. ، الذي التعبير مؤقتة من DLL1 وNotch1 في PSM الذيلية قد تم أقل جيدا الحفاظ 9.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان تقنية
مرة واحدة وقد أتقن هذا البروتوكول، وتحليل التعبير عالية الإنتاجية لا يمكن أن يؤديها أي بروتين من الفائدة في إدارة المشتريات والتوريدات.إإكسبلنتس PSM الناتجة عن عدة ليترات الماوس يمكن معالجتها في وقت واحد لتوليد عدد العينات عالية الضروري لتحليلها. على الرغم من أننا قد استخدمت فقط البرية من نوع الأجنة في هذه الدراسات، فمن الممكن لإجراء هذا التحليل باستخدام أجنة المعدلة وراثيا من أجل تقييم أهمية العوامل واحد أو أكثر على ديناميكية تعبير البروتين. ما وراء PSM، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لغيرها من النظم التي تتكون من نصفين المقابل، ويمكن استخدامها للكشف عن حساسية على مستوى منخفض تعبير البروتين ومتذبذبة ديناميات. ومن الأمثلة التي يمكن تكييفها هذا البروتوكول هو دراسة تعبير البروتين الحيوي في الأنبوب العصبي الماوس، منذ نصفين المقابل يمكن توليدها وتربيتها، ولقد ثبت النشاط الشق على حد سواء في الحاضر والمهم بالنسبة الزخرفة 15. ونحن نشجع مجموعات أخرى للتكيف مع هذا البروتوكول إلى أنظمة أخرى وتقديم التغذية الراجعة للتحسين في المستقبل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل دراسية لجنة نهر الميكونج إلى RAB، وهو دراسية لجنة نهر الميكونج إلى CSLB، ومنحة مشروع WT إلى JKD (WT089357MA). وأيد العمل أيضا على جائزة الثقة الاستراتيجية الترحيب (097945 / Z / 11 / Z). نشكر الدكتور E. Kremmer للهدية نوع من الأجسام المضادة DLL1 والدكتور سين Pourquie للتحقيق Lfng الحمض النووي الريبي.
Materials
| DMEM-F12 | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 11320033 | |
| GlutaMAX™-1 (100X) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 35050 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10270106 | |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140122 | |
| anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^ | BD Pharmingen | 552466 | |
| anti-rat polyclonal Dll1 antibody^* | N/A | N/A | |
| Lfng intronic anti-sense RNA probe^* | N/A | N/A | |
| 16% paraformaldehyde | Pierce (ThermoFischer Scientific) | PI28908 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche (Sigma-Aldrich) | 31158 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH7.4 | Made in house | N/A | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Normal goat serum (NGS) (heat-treated) | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 16210072 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer Scientific | H3570 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Saline-sodium citrate (SSC) | Sigma-Aldrich | 93017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | |
| tRNA | Roche (Sigma-Aldrich) | 101095 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Made in house | N/A | |
| Blocking Buffer Reagent | Roche (Sigma-Aldrich) | 11096176001 | |
| anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody | Roche (Sigma-Aldrich) | 11207733910 | |
| Tyramide signal amplification (TSA) kit | Perkin Elmer | NEL744001KT | |
| *NOTE: The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources. | |||
| ^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader. | |||
References
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139 (4), 625-639 (2012).
- Krol, A. J., Roellig, D., et al. Evolutionary plasticity of segmentation clock networks. Development. 138 (13), 2783-2792 (2011).
- Dequéant, M. -. L., Ahnert, S., et al. Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock. PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).
- Bailey, C., Dale, K. . Somitogenesis in Vertebrate Development. , 1-15 (2015).
- Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. Somitogenesis. Development. 139 (14), 2453-2456 (2012).
- Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock. Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).
- Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites. PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).
- Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock. eLife. 4, 05842 (2015).
- Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).
- Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis. Cell. 149 (2), 295-306 (2012).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nature communications. 3, 1141 (2012).
- Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM. Development. 141 (24), 4806-4816 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).
- Denkers, N., García-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos. Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).
- Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo. Development. 142 (13), 2291-2303 (2015).
