Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

Bütün deneyler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) 1986 Yasası ve bilimsel işlemlerde hayvanların kullanımı için Uygulama İngiltere Home Office Kodları sıkı sıkıya bağlı kalmanın proje lisans numarası 6004219 altında gerçekleştirildi. 1. PSM Eksplantasyon Diseksiyon Wild-tip (CD1) farelerin 13 zamanlı çiftleşme tarafından üretilen embriyolar kuyruk dokusu elde. Kısaca, embriyonik gün (D) 10,5, bir karbon diyoksit odasında hamile, verici bir fare euthanize. uterin boynuz hasat ve Home Office Lisans prosedürleri veya eşdeğer yerel kurallara uygun olarak 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içine yerleştirin. Taze, steril PBS içeren bir doku kültürü çanak uterin boynuz aktarın. Bu çözümde sonraki tüm diseksiyon adımları uygulayın. Bir stereomikroskop altında, kavisli makas kullanarak uterin boynuz kalın kas zarı kesme ve dikkatle ince forseps kullanarak her bir embriyo ayıklayın. Kendine iyi bakkuyruk dokusu bu süreçte zarar görmediğinden emin olmak için. embriyoyu zarar vermemeye özen her embriyo amniyon kesesi uzak teşrih, kavisli makas ve ince forseps kullanarak. Arka bacak tomurcukları embriyo posterior keserek her embriyonun kuyruk dokusu hasat için bir cerrahi iğne veya kavisli makas kullanınız. forseps ve bir iğne her ikisini de kullanarak kuyruk dokusu ventral tarafı aşağı dengeleyin. orta hat boyunca ikiye kuyruk dokusu diseksiyon her embriyonik kuyruk PSM eksplant çiftleri oluşturmak; Bir iğne ile yumuşak sallanan hareketi gerçekleştirin. Nöral tüp, notokord ve PSM dokusu eşit olarak iki eksplant arasında bölünmüş emin olun. +% 0.1 L-glutamin yerine,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış (37 ° C), kültür ortamı (DMEM-F12, küçük bir hacim içinde 35-mm plastik kültür kabı kapağının alt üzerine her karşı PSM eksplant Pipet 10 nM insan bFGF, ve% 1 penisilin / streptomisin). <li> kapağın üstüne çanak yerleştirin ve hızlı bir şekilde PSM doku ortamının bir "asılı damla" olarak kapağın askıya böylece onu çevirin. Kültür 1, 37 ° C'de nemlendirilmiş bir haznede lekelenmiştir PSM eksplantlar – 2 saat. 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden PSM eksplantlar devri çiftleri. gece boyunca, oda sıcaklığında (RT) ya da 4 ° C 'de 1 saat süreyle (O / N), PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde inkübe edin. DİKKAT: Paraformaldehid toksiktir ve bu çözelti ile birlikte çalışan, uygun güvenlik önlemleri alınması gerekir. Not: 24 oyuklu doku kültürü plakası sonraki tüm yıkama ve inkübasyon adımları. 4 kez – Taze PBS 3 örnek üzerinde PBS çözeltisi alışverişi için iyi bir plastik pastör pipeti kullanılarak, sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde numune kuyuları yıkayın. (Immünhistokimya (adım 2) ve bilinen bir saat geni için in situ hibridizasyon diğer kullanarak floresan kullanarak st her çiftten biri PSM eksplant SüreçEP 3). PSM Eksplantlarından 2. İmmunohistokimya sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde% 2 Triton X-100, aşama 1 'de üretilen her embriyo çiftten bir PSM eksplant yıkayın ve daha sonra PBS içinde kısa bir süre örnekleri yıkayın. sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de ve inkübe O bloke etme çözeltisi (PBS +% 0.1 Tween-20 içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS)) / N numuneler PBS değiştirin. NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu bölüm içinde bulunan sonraki yıkama sıvıları ve inkübasyon adımları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Yıkama çözeltileri kolayca ince uçlu bir plastik ya da cam Pasteur pipet kullanılarak değiştirilebilir. Çalışma tamponu içinde istenen birincil antikor / antikorlar seyreltilir (% 0.1 BSA,% 0.3 NGS ve PBS içinde% 0.2 Triton X-100). Bu örnekte, tampon çalışma DLL1 ve Notch1 antikorları 1:25 seyreltin. NOT: Optimizasyon thi gerekli uygun seyreltme faktörünü belirlemek için gerekli olacaktırAlternatif antikorlar kullanılırsa s adımı. sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de 5 gün – 3 antikor çözeltisi içinde eksplantlar inkübe edin. Sekonder antikor kontrolleri olarak hareket etmek birincil antikor içeren tampon ile çalışan bazı örnekler şunlardır emin olun. bir pipet kullanılarak 1.5 mL depolama tüpünde birincil antikor çözeltisi elde etmek ve 4 ° C 'de muhafaza edin. Not: Geri kazanılmış birincil antikor kullanılan antikora bağlı olarak, birçok kez kullanılabilir. sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde% 2 Triton X-100, 10 dakika her biri için 3 yıkama yapılmıştır PBS içinde 10 dakika her biri, – 5 Örneklerin 2 yıkama yapın. floresan etiketli ikincil antikor / antikorlar seyreltilir buferi (birincil antikora epitop eşleşen / antikorlar kullanılır). İsteğe bağlı olarak, çekirdek counterstain Bu çözeltiye 20 ug / ml Hoechst 33342 ekleyin. Not: Optimizasyonu Bu aşamada gerekli uygun seyreltme faktörünü belirlemek için gerekli olabilir. Bu example, 1 bir seyreltme faktörü: 400, tipik olarak kullanılmıştır. Antikor agregatların oluşumunu önlemek için 16 x g'de 10 dakika süre ile ikincil antikor çözeltisi santrifüjleyin. Antikor agregalar ihtiva edebilir çözeltisi son birkaç mikrolitre kullanmamaya dikkat ederek, her bir numune için ikincil antikor çözeltisinin 500 ul – 250 ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'de 5 gün – ışığa maruz kalma en aza indirmek ve 3 ikincil antikor çözeltisinin örnekleri inkübe kalay folyo ile örnek plaka örtün. Montaj örnek PBS içinde% 0.1 Tween-20 içinde 10 dakika her biri (PBST) ile sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde bir kez 5 dakika boyunca iki kez numune yıkama öncesinde (adım 4). PSM Eksplantlarından Yerinde Hibridizasyon (FISH) 3. Floresan Alternatif bir kap içinde saklanması durumunda, 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden kalan karşı PSM eksplantlar aktarın. için numune yıkayın10 PBST içinde% 50 etanol içinde dakika, ve daha sonra doku kurutmak için oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde 10 dakika boyunca% 100 etanol içinde her biri 2 yıkama yapar. NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu bölüm içinde bulunan sonraki yıkama sıvıları ve inkübasyon adımları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. PBST içinde her biri 5 dakika iki kez yıkanır, PBST içinde% 50 etanol içinde 10 dakika boyunca yıkama doku rehidrate. NOT: 3.2 ve 3.3 bu protokol için gerekli sabitleme adımlardır ve ihmal edilemez adımları. çalkalama olmaksızın 5 dakika boyunca PBS (PBST),% 0.1 Tween-20, 10 ug / ml proteinaz K ile inkübe edin. Hızla proteinaz K kaldırmak ve PBST% 4 formaldehit +% 0.1 gluteraldehit 30 dakika süreyle doku post-sabitleme kısa bir süre önce PBST ile örnekleri durulayın. DİKKAT: formaldehit ve glutaraldehit Hem toksik ve bu çözümler ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır. NOT: Aşağıdaki yıkamave% 50 ve% 100 melezleştirme karışımları (3.6 adım – 3.9) içeren bekletme işlemleri çalkalama olmaksızın gerçekleştirilmelidir. PBST içinde 10 dakika her biri için iki numune yıkandıktan sonra, intronik problar için (% 50 hibridizasyon karışımı bir kez uygun bir örneği yıkama:% 50 formamid, 5x salin sodyum sitrat (SSC), 5 mM EDTA, 50 ug / ml tRNA, % 0.2 Tween-20,% 0.1 SDS ve PBST içinde 100 ug / ml heparin) oda sıcaklığında hazırlandı. çalkalama olmaksızın 65 ° C de, 10 dakika boyunca bu çözelti içinde inkübe edin. 65 ° C'de (48 saat kadar) ≥ 2 saat boyunca melezleştirme karışımı örnekleri inkübe edildi önceden ısıtılmış (65 ° C) hibridizasyon karışımı ile iki kez numune durulayın (daha uzun inkübasyon süreleri, elde edilen sinyal-gürültü kontrastı arttırmak) . Önceki aşamadan elde edilmiş hibridizasyon karışımı çıkarın ve 0.25 ile değiştirin – önceden ısıtılmış 0.5 mL (65 ° C) digoksigenin (DIG) bilinen bir segmentasyon saat bileşenine karşı anti-sens RNA probu -etiketli ihtiva eden hibridizasyon karışımı. DEĞİLE: Örneğin, bir intronik kanadını (Lfng (I) ') probu olgunlaşmamış Lfng mRNA tespit etmek için 20 ul / ml'lik bir konsantrasyonda kullanıldı. Bu basamakta kullanılan seyreltme prob bağlıdır ve optimizasyon gerektirir. buharlaşmasını önlemek ve 65 ° C 'de iki gece prob çözeltisi örnekleri inkübe yapışkan bandı kullanarak plakayı kapatın. ince uçlu plastik Pasteur pipeti kullanarak, yeniden kullanım için prob kurtarmak ve 20 ° C'de saklayın. Ön 65 ° C de 20 dakika her biri için numuneler iki kez yıkanmasından önce, önceden ısıtılmış (65 ° C) olarak hibridizasyon sonrası karışımı (% 50 formamid,% 0.2 Tween-20 ve 1 x SSC) ile iki kez numune durulayın post-hibridizasyon karışımı ısındı. Tris-tamponlu tuzlu su çözeltisi (TBST) içinde% 0.1 Tween-20 içinde önceden ısıtılmış% 50 hibridizasyon karışımı içinde 65 ° C'de 15 dakika boyunca numune yıkanır. sallanan bir platform üzerinde TBST içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yıkanmasından önce TBST ile iki kez numune durulayın. blo eksplantlar önceden inkübecking çözeltisi (TBST +% 2 tampon reaktifi (BBR) +% 20 ısı ile muamele edilmiş keçi serumu engelleme), 2 saat içinde en az. 1 ihtiva eden taze bloklama çözeltisi ile değiştirin Çözüm: yaban turbu peroksidazı (HRP), 200 seyreltme, anti-digoksigenin antikor ile konjüge edilmiş. 4 ° C'de numunelerin O / N inkübe edin. Antikor inkübe edildikten sonra oda sıcaklığında numuneleri TBST ile 3 kez yıkayın ve yeni bir 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden aktarın. 1 saat için her TBST ile 3 kez eksplantlar yıkayın. Bu noktada, aşağıdaki adımlarda Tyramide sinyal amplifikasyonu (TSA) saptama reaktifleri gerekli miktarını azaltmak için, 0.5 mL 'lik bir depolama tüpler ya da 48 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden numuneleri aktarın. ajitasyon, mümkün olduğu kadar küçük bir hacim kullanılarak numuneler tam çözeltisine daldırıldığı emin olmadan 1 dakika için oda sıcaklığında TSA amplifikasyon tamponu örnekleri (reaktif listesine bakınız) inkübe edin. (bkz TSA reaktif ekleyin1:50 seyreltmede Örnek amplifikasyon tamponu reaktiflerin listesi). Hızla TSA reaktif eşit dağıtılmış kadar çözüm karıştırmak kalay folyo levha veya tüpler kapak ve 60 için örnekler inkübe – karanlıkta 90 dakika. TSA amplifikasyon çözüm çıkarın ve 5 dakika her TBST 3 kez numune yıkayın. 1 saat boyunca TBST içinde% 1 hidrojen peroksit örnekleri yıkama hacmini artırmak ve inkübasyona 24 oyuklu doku kültürü plakası geri eksplantlar aktarın. Her biri 5 dakika süreyle TBST ile 3 kez numune yıkanır ve sonra da iki kez 5 dakika boyunca, her PBST ile önceden monte örnek (adım 4). Görüntüleme 4. Numune Hazırlama Bir lamel eklenmesi ile ezilmiş kalmasını engellemek 0.12 mm kalınlığında görüntüleme ara parçalar ekleyerek her eksplant çifti için bir ücret yapışma cam slayt hazırlayın. f presleme bir ara parçanın bir yüzeyine yapışkan astarını çıkarın ve bir cam slayt üzerine aşağı yapışkanlı tarafı yerirmly slayt ayırıcı mühür. NOT: Kalan adımlar için, photobleaching önlemek için düşük ışık koşullarında veya karanlıkta örnekleri tutmak için çaba. eksplant disseke yan slayt karşı karşıya sağlanması, ara parçasının merkezi içinde bir cam Pasteur pipeti kullanarak hazırlanmış bir slayt üzerine Pipet eksplant çiftleri. yan eksplantlar yan taraf çiftleri düzenleyin. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak slayt mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve katlanmış az tüylü doku kağıt parçası kullanarak örnekleri çevreleyen herhangi bir kalıntı nemi fitil. Doku yapışkan ve saydam görünmesini başlayana kadar, 60 s – numuneler 45 slayt uymak için izin verin. Bu süre boyunca, forseps kullanılarak aralama kalan yapışkan astar çıkarın. Numuneler kurumasına izin vermeyin. merkezi içinde örnekleri (% 90 gliserol içinde% 0.5 p-fenilendiamin ve 20 mM Tris, pH 8.8,) Çift fonksiyonlu mountant ve temizleme çözeltisinin büyük damla eklemeara parçasının. NOT: okside izin Bu çözüm siyah / kahverengi döner. Dikkatle mountant eşit dağıtılmış olduğunu ve lamel tüm kenarlarında ayırıcı ile temas sağlanması, numuneler üzerinde dairesel bir lamel (no. 1.5) yerleştirin. baş aşağı bazı düşük tüy bırakmayan doku kağıt üzerine kapak astarlı slayt yerleştirin. Lamel tam ayırıcı yapıştığı ve herhangi bir aşırı mountant kaldırılır emin olmak için sıkıca bastırın. artık mountant lekeleri kağıt kadar tekrarlayın. Temiz ve uygun slayt (ler) etiket ve görüntüleme -20 ° C'de, kısa süreli ya da -80 ° C'de uzun vadede kadar karanlıkta saklayın. Depolama slaytları çıkardıktan sonra, onları tamamen görüntüleme önce çözülme sağlar. Görüntü kiremitli edinimi ve yüksek büyütme amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak monte örnekleri. Görüntü 488 nm, 568 nm ve 647 nm lazer li kullanılarak 4 mikron z-aralıklarla 40X immersiyon yağı hedefi kullanarak eksplant çiftlerines, yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı fluorophores, sırasıyla, bu çalışmada 12 protein ve mRNA tespiti için kullanılan heyecanlandırmak için. NOT: Çinili görüntüleri analiz için tek bir görüntü oluşturmak için alım sonrası dikişli bulundu. 5. Post-satın alma Görüntü Analizi Her deney numunesine ait PSM içinde ilgi bölgeyi tanımlamak için görüntü analiz yazılımı kullanın. sonraki ölçümü öncesinde no-birincil kontrol numunesinin seviyesine ifade seviyelerini, çıkarma arka plan ve eşik görüntüleri ölçmek için. bir kökeni, bir eksen, ve her bir numune için bir birim uzunluğu tanımlamak için kullanılır. M örnekleri 12 her biri için normalize Rostro-kaudal ekseni boyunca pozisyonun bir fonksiyonu olarak floresans yoğunluğunu hesaplar. Yoğunluk araziler normalize sonra, i de şiddetini tanımlayan bir yoğunluk matrisi f (i, j) yan yoğunluk profilleri yan yerleştirin ve elde <snumune inci j mekansal pozisyon th> kadar. Numunelerin 6. Geçici Sipariş Bilinen bir saat bileşeninin zamansal sipariş anlaması, onun yoğunluğu matrisi tanımlar. zamansal düzenli desen elde etmek üzere sonra, yoğunluk matris sütun yeniden. Bunu yapmak için, işlev tanımlayın A (f j, k) burada f ve A T sütunun inci j otokorelasyon fonksiyonunu temsil tarafından verilen desen zamansal periyotlarını uygulamak için seçilen bir hedef otokorelasyon fonksiyonu, bir Fonksiyon g minimize örneklerin sırasını belirlemek için Metropolis-Hastings (veya başka bir minimizasyonu algoritması) 12 kullanın. Böylece, sırasını belirlemekBilinen bir saat bileşeninin zamansal periyotlarını maksimize M örnekleri. M örneklerinin olayla zamansal sıralaması kullanılarak, ortaklı kanalda 12 ifade deseni için bir sipariş kymograph inşa.