Temporal Упорядочение динамических данных выражений из конкретных пространственных Expression Maps

Все эксперименты проводились в рамках проекта лицензии № 6004219 в строгом соответствии с животными (научные процедуры) Закона 1986 года и коды Великобритании Home Office, Практическое руководство по использованию животных в научных процедур. 1. PSM эксплантата Вскрытие Получить хвост ткани из эмбрионов , полученных в заданное время спаривания дикого типа (CD1) мышей 13. Если коротко, то на эмбриональный день (E) 10,5, усыпить беременной мыши доноров в камере диоксида углерода. Урожай рог матки и поместить его в раствор стерильно 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в соответствии с процедурами лицензирования Министерства внутренних дел или эквивалентных местных правил. Передача рога матки к культуре блюдо ткани, содержащей свежие, стерильные PBS. Выполнить все последующие шаги рассечение в этом растворе. Под стереомикроскопа, перерезать толстую мышечную оболочку рога матки с помощью изогнутых ножниц и извлечения каждого эмбриона тщательно с использованием тонких щипцов. Береги себячтобы гарантировать, что хвостовой ткани не повреждается в этом процессе. Используя изогнутые ножницы и тонких щипцов, отсечь амниотической мешок из каждого эмбриона, следя за тем, чтобы не повредить зародыш. Используйте либо хирургические иглы или изогнутые ножницы, чтобы собрать хвост ткани каждого эмбриона путем разрезания эмбриона кзади задних зачатки конечностей. Баланс хвоста ткани вентральной стороной вниз с использованием как пинцет и иглу. Генерация пары PSM эксплантов из каждого эмбрионального хвоста путем рассечения хвоста ткани на две половины вдоль средней линии; выполнить легкое качательное движение с помощью иглы. Убедитесь в том, что нервная трубка, хорда и ПСМ ткани делятся поровну между двумя эксплантов. Пипетировать каждый контралатеральной PSM эксплантов на нижней стороне пластика культуральную чашку крышкой 35 мм в небольшом объеме предварительно нагретом (37 ° С) культуральной среды (DMEM-F12 + 0,1% L-глутамина, заменителем, дополненной 10% фетальной сыворотки теленка , 10 нМ человеческого Bfgf, и 1% пенициллина / стрептомицина). <li> Поместите блюдо на верхней части крышки и быстро переверните его так, чтобы ткань PSM подвешен крышки в "висячей капли" среды. Культура эксплантов ПСМ в увлажненной камере при 37 ° С в течение 1 – 2 ч. Передача пар PSM эксплантов на отдельные лунки 24-луночного планшета для культуры ткани с. Выдержите в 4% параформальдегид в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) или 4 & deg; C в течение ночи (O / N). ВНИМАНИЕ: параформальдегид является токсичным, а также надлежащие меры предосторожности должны быть приняты при работе с этим решением. Примечание: Выполнить все последующей промывкой и инкубацию шаги в 24-луночный планшет для тканевых культур с. Отмывки образца скважин в PBS при комнатной температуре на качающейся платформе, с помощью тонкой пластиковой пипетки Пастера для обмена раствора PBS на образцах свежей PBS 3 – 4 раза. Процесс один PSM эксплантов из каждой пары с помощью иммуногистохимии (этап 2) , а другой с помощью флуоресцентной гибридизация для гена известны часы в (улер 3). 2. Иммуногистохимия PSM эксплантов Промыть один PSM эксплантов из каждой пары эмбрионального сгенерированного на шаге 1, в 2% Тритон Х-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном платформе, а затем промыть образцы на короткое время в PBS. Заменить PBS на образцах с блокирующим раствором (2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 10% сыворотки нормальной козьей (NGS) в PBS + 0,1% твин-20) и инкубировать O / N при 4 ° С на качающейся платформе. Примечание: Все последующие промывает и стадии инкубации в этой секции должны быть выполнены при комнатной температуре на ротационном платформе, если не указано иное. растворы для промывки могут быть легко изменены с помощью остроконечного пластика или стекла пипетки Пастера. Развести желаемых первичных антител / антитела в рабочем буфере (0,1% BSA, 0,3% NGS, и 0,2% Тритон Х-100 в PBS). В этом примере, разбавленные антитела Dll1 и Notch1 1:25 в рабочем буфере. Примечание: Оптимизация потребуется для определения соответствующего коэффициента разбавления требуется в This шаг, если используются альтернативные антитела. Выдержите эксплантов в раствор антител в течение 3 – 5 дней при температуре 4 ° С на качающейся платформе. Не забудьте включить некоторые образцы с рабочим буфером, не содержащий первичное антитело, чтобы действовать в качестве контроля вторичных антител. Восстановление раствора первичного антитела в трубке хранения 1,5 мл с помощью пипетки и хранить его при температуре 4 ° С. Примечание: Восстановленные первичное антитело может быть использовано несколько раз, в зависимости от используемого антитела. Выполните 2 промывками образцов в течение 5 – 10 мин каждый в PBS, а затем 3 промывок в течение 10 мин каждый в 2% Тритон Х-100 в PBS при комнатной температуре на ротационном платформе. Развести флуоресцентно меченого вторичного антитела / антитела (эпитоп соответствием с первичным антителом / использовали антитела) в рабочем буфере. При желании можно добавить 20 мкг / мл Hoechst 33342 к этому раствору, чтобы контрастное ядер. Примечание: Оптимизация может потребоваться, чтобы определить соответствующий коэффициент разбавления, необходимое на этом этапе. В этом еXample, коэффициент разбавления 1: был обычно используется 400. Центрифуга раствор вторичного антитела в течение 10 мин при 16 XG, чтобы предотвратить образование агрегатов антител. Добавить 250 – 500 мкл вторичного раствора антител к каждому образцу скважины, следя за тем, чтобы не использовать последние несколько микролитров раствора, который может содержать агрегаты антител. Накройте образец пластины с фольгой, чтобы свести к минимуму воздействия света и инкубировать образцов в растворе вторичного антитела в течение 3 – 5 дней при температуре 4 ° С в темноте. До крепления образца мыть образцы дважды в течение 10 мин каждый раз в 0,1% Tween-20 в PBS (PBST) и один раз в течение 5 мин в PBS при комнатной температуре на ротационном платформе (этап 4). 3. Флуоресцентные В гибридизация (FISH) ПСМ эксплантов При хранении в альтернативном судне, передавать оставшиеся контралатеральной эксплантов PSM на отдельные лунки 24-луночного планшета для культуры ткани с. Вымойте образцы для10 мин в 50% этанола в PBST, а затем выполняют 2 промывок в течение 10 минут каждый в 100% этанола на качающейся платформе при комнатной температуре обезвоживает ткани. Примечание: Все последующие промывает и стадии инкубации в этой секции должны быть выполнены при комнатной температуре на ротационном платформе, если не указано иное. Увлажняет ткани путем промывки в течение 10 мин в 50% этаноле в PBST, с последующей промывкой дважды в течение 5 мин каждый в PBST. Примечание: Шаги 3.2 и 3.3 необходимые шаги, необходимые для фиксации этого протокола и не могут быть опущены. Инкубируйте образцы с 10 мкг / мл протеиназы К в 0,1% Tween-20 в PBS (PBST) в течение 5 мин без перемешивания. Быстро удалить протеиназы К и прополоскать образцы кратко с PBST перед тем после фиксации ткани в течение 30 мин в 4% раствор формальдегида + 0,1% глутарового альдегида в PBST. ВНИМАНИЕ: Оба формальдегид и глутаральдегид являются токсичными, а также надлежащие меры предосторожности должны быть приняты при работе с этими решениями. Примечание: Следующая стиральнаяи стадии инкубации с участием 50% и 100% гибридизационных смеси (шаги 3.6 – 3.9) следует проводить без перемешивания. После промывки образцов в два раза в течение 10 мин каждый раз в PBST, мыть образцы один раз в 50% смеси гибридизация (подходит для интронных зондов: 50% формамида, 5x цитрат физиологическим раствором натрия (ССК), 5 мМ ЭДТА, 50 мкг / мл т-РНК, 0,2% твина-20, 0,1% SDS и 100 мкг / мл гепарина) в PBST готовили при комнатной температуре. Инкубируйте образцы в этом растворе в течение 10 мин при 65 ° С без перемешивания. Промыть образцы дважды с предварительно нагретом (65 ° C) гибридизация смеси до инкубации образцов в гибридизационных смеси в течение ≥ 2 ч (до 48 ч) при 65 ° С (более длительное время инкубации улучшить результирующий сигнал-шум, контраст) , Удалите гибридизационная смесь из предыдущего шага, и заменить его на 0,25 – 0,5 мл подогретого (65 ° C) гибридизация смеси содержащей дигоксигенином (DIG) меченных анти-смысловой РНК-зонда против известного компонента сегментации часов. НЕЕ: Например, интронного лунатиков (Lfng (I)) зонд был использован в концентрации 20 мкл / мл , чтобы обнаружить возникающую мРНК LFNG. Разбавление используемое на этой стадии является зонд-зависимый и потребует оптимизации. Уплотнение пластины с использованием липкой лентой для предотвращения испарения и инкубировать образцов в растворе зонда в течение двух суток при температуре 65 ° C. С помощью остроконечного пластиковую пипетку Пастера, восстановить зонд для повторного использования и хранить его при температуре 20 ° С. Промыть образцы дважды с предварительно нагретом (65 ° С) после гибридизация смеси (50% формамид, 0,2% твин-20, и 1x SSC) перед стиркой образцов еще два раза в течение 20 минут каждый при 65 ° С в предварительно нагревают после гибридизации смеси. Промыть образцов в течение 15 мин при температуре 65 ° С в предварительно нагретый 50% смеси гибридизационного в 0,1% твина-20 в Трис-солевом буферном растворе (TBST). Промыть образцы дважды TBST перед стиркой в ​​течение 30 мин при комнатной температуре в TBST на качающейся платформе. Предварительно инкубировать эксплантов в БлоCking раствор (TBST + 2% блокирующим буферным раствором реагента (BBR) + 20% термообработанного козьей сывороткой) в течение как минимум 2 ч. Заменить этот раствор свежим блокирующим раствором, содержащим 1: 200 разбавление с пероксидазой хрена (HRP) анти-дигоксигенином антитела. Инкубируйте образцы O / N при температуре 4 ° С. После инкубации антитела, ополоснуть образцов 3 раза TBST при комнатной температуре и передавать их на отдельные лунки нового 24-луночного планшета для культуры ткани. Промыть эксплантов с TBST 3 раза в течение 1 ч каждый. На данный момент, передать образцы в 0,5 мл пробирки для хранения или отдельные лунки 48-луночного планшета для культуры ткани с, чтобы уменьшить необходимый объем реагентов для обнаружения сигнала усиления Tyramide (TSA) в следующих шагах. Инкубируйте образцы в АСП амплификации буфере (список реагентов) при комнатной температуре в течение 1 мин без перемешивания с использованием в качестве небольшого объема, как это возможно, убедившись, что образцы полностью погружены в раствор. Добавьте реагент TSA (смСписок реагентов) в буфер амплификации образца в разведении 1:50. Быстро перемешать раствор до тех пор пока реагент АСП не распределяется равномерно, покрывают пластины или трубы в оловянной фольги, и инкубировать образцов в течение 60 – 90 мин в темноте. Удалите раствор амплификации TSA и мыть образцы в TBST 3 раза в течение 5 минут каждый. Передача эксплантов обратно в 24-луночного планшета для культуры ткани в увеличивать объем стирки и инкубировать образцов в 1% -ной перекиси водорода в TBST в течение 1 ч. Промыть образцы с TBST 3 раза в течение 5 мин каждый раз, а затем два раза в течение 5 мин каждый с PBST до крепления образца (этап 4). 4. Подготовка образцов для обработки изображений Подготовьте один заряженный адгезию предметное стекло для каждой пары эксплантов путем добавления толстых распорки изображений 0,12-мм, которые предотвращают образцы от раздавливания путем добавления покровным. Удалите клейкую полоску с одной поверхности прокладки и поместить его клейкой стороной вниз на предметное стекло, нажав Firmly для герметизации распорки на слайде. Примечание: Для остальных шагов, стремиться сохранить образцы в условиях низкой освещенности или в темноте, чтобы избежать фотообесцвечивания. Пипетка пары эксплантов на подготовленных слайд с помощью стеклянной пипетки Пастера в центре обработки спейсера, гарантируя, что расчлененный сторона эксплантов сталкивается с горкой. Устройте контралатеральной пары эксплантов бок о бок. Удалить как можно больше жидкости, как это возможно из слайда с помощью стеклянной пипетки Пастера и фитиль от любой остаточной влажности окружающего образцы, используя кусок сложенной бумаги ткани низкого ворса. Разрешить образцы придерживаться слайда в течение 45 – 60 секунд, пока ткань не начинает казаться липким и прозрачным. В течение этого времени, удалите остатки клея вкладыш из распорки с помощью щипцов. Не позволяйте образцы высохнуть. Добавьте большую каплю бифункциональных mountant и клирингового раствора (0,5% п-фенилендиамина и 20 мМ Трис, рН 8,8, в 90% глицерина) к образцам в центрепроставки. Примечание: Это решение становится коричневым / черным, когда разрешено окисляется. Осторожно поместите круглую покровное (нет. 1.5) по образцам, гарантируя, что mountant распределяется равномерно и что все ребра покровного стекла в контакт с прокладкой. Поместите крышку-просочился слайд вниз головой на некоторую папиросную бумагу низкого ворса. С небольшим усилием надавите, чтобы гарантировать, что покровное полностью придерживается проставки и что любой избыток mountant удаляется. Повторяйте, пока не более mountant кляксами бумагу. Чистый и маркировать слайд (ы) надлежащим образом, а не хранить их в темноте до формирования изображения, краткосрочные при -20 ° С или долгосрочной перспективе, при -80 ° С. После удаления слайды из хранения, позволяют им полностью разморозить, прежде чем визуализации. Изображение смонтированные образцы с помощью конфокальной микроскопии с плиточным приобретением и высокой цели увеличения. Изображение пары эксплантов с использованием объектива масла погружения 40X на 4-мкм Z-интервалов с использованием 488 нм, 568 нм и 647-нм лазер Liуказанные в другом месте , чтобы возбудить зеленый, красный, и дальнего красного флуорофоров, соответственно, используемые для обнаружения белка и мРНК в этом исследовании 12. ПРИМЕЧАНИЕ: Плиточные изображения были сшиты после приобретения для формирования единого изображения для анализа. 5. После сбора анализа изображений С помощью программного обеспечения для анализа изображений для определения области, представляющей интерес в PSM каждого экспериментального образца. Для количественной оценки уровней экспрессии, вычитать фон и пороговые изображения на уровне процедуры отсутствия первичного контрольного образца, перед последующим квантификации. Определить происхождение, ось, и единицы длины для каждого образца. Рассчитать интенсивность флуоресценции в зависимости от положения вдоль нормированного ростро-каудальной оси для каждой из М выборок 12. После нормализации графики интенсивности, поместите сторону профилей интенсивности бок и получить матрицу интенсивности F (I, J) , который описывает интенсивность в I <sвверх> й пространственной позиции в J – й пробы. 6. Временная Заказ образцов Для того, чтобы вывести временную упорядоченность известного компонента часов, определить ее матрицу интенсивности. Затем переставить столбцы матрицы интенсивности, с тем, чтобы получить временно периодический шаблон. Для этого определим функцию где А (е J; к) представляет собой автокорреляционную функцию J – го столбца Г и Т является функцией целевой автокорреляции, выбирается для обеспечения временной периодичности рисунка, задается Используйте Метрополиса-Гастингса (или другой алгоритм минимизации) 12 , чтобы определить порядок образцов , которые сводят к минимуму функции г. Таким образом, определяют порядок изM образцы, которые максимизирует временную периодичность известного компонента часов. Использование INFERRED временного упорядочения М выборок, построить упорядоченную кимографе для паттерна экспрессии в Partnered канале 12.