Temporal bestellen van Dynamic Expression gegevens van Uitgebreide Ruimtelijke Expression Maps

Alle experimenten werden uitgevoerd in het kader van project licentie nummer 6004219 in strikte naleving van de Dieren (Scientific Procedures) Act van 1986 en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken gedragscodes voor het gebruik van dieren in wetenschappelijke procedures. 1. PSM Explantatie Dissection Haal de staart weefsel van embryo's die door de getimede paring van wild-type (CD1) muizen 13. In het kort, op embryonale dag (E) 10,5, euthanaseren de zwangere donor muis in een kooldioxide-kamer. Oogst de baarmoeder hoorn en plaats het in 1x steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing in overeenstemming met kantoor aan huis License procedures of gelijkwaardige plaatselijke regels. Breng de baarmoeder hoorn om een ​​weefselkweek schotel met verse, steriele PBS. Voer alle verdere dissectie stappen in deze oplossing. Onder een stereomicroscoop, snijd de dikke gespierde membraan van de baarmoeder hoorn met behulp van gebogen schaar en uitpakken elk embryo zorgvuldig met behulp van fijne pincet. Wees voorzichtigzodat de staart weefsel niet hierbij beschadigd. Met behulp van gebogen schaar en fijne tang, ontleden weg de vruchtzak van elk embryo, het verzorgen van het embryo niet te beschadigen. Gebruik ofwel een chirurgische naald of gebogen schaar om de staart weefsel van elk embryo oogst door het snijden van het embryo posterior aan de achterzijde ledematen. De balans van de staart weefsel ventrale naar beneden met behulp van zowel pincet en een naald. Genereer paren van PSM explantaten uit elke embryonale tail door het ontleden van de staart weefsel in twee helften langs de middellijn; het uitvoeren van een zachte schommelende beweging met een naald. Zorg ervoor dat de neurale buis, notochord en PSM weefsel gelijkelijk worden verdeeld tussen de twee explantaten. Pipetteer elk contralaterale PSM explantaat op de onderzijde van een plastic kweekschaal deksel 35 mm in een klein volume van voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium (DMEM-F12 + 0,1% L-glutamine substituut gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum , 10 nM menselijk bFGF, en 1% penicilline / streptomycine). <li> Zet de schaal aan de bovenkant van het deksel en snel omkeren het zo dat de PSM weefsel is opgehangen aan het deksel een "opknoping drop" drager. Cultuur de PSM explantaten in een bevochtigde kamer bij 37 ° C gedurende 1-2 uur. Overdracht paren PSM explantaten aan de individuele putjes van een 24 putjes weefselkweekplaat. Incubeer in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (KT) of 4 ° C overnacht (O / N). LET OP: Paraformaldehyde is giftig, en passende veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met deze oplossing. Opmerking: Voer alle daaropvolgend wassen en incubatie stappen in een 24-well weefselkweekplaat. Was het monster putjes in PBS bij kamertemperatuur op een schudplatform, met een fijne plastic Pasteur pipet om de PBS-oplossing op de monsters te wisselen voor verse PBS 3-4 keer. Na verwerking PSM explantaat van elk paar met behulp van immunohistochemie (stap 2) en de andere met fluorescerende in situ hybridisatie voor een bekende klokgen (step 3). 2. Immunohistochemie van PSM Explantaten Was één PSM explantaat uit elk embryo paar gegenereerd in stap 1 in 2% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat en spoel monsters kort in PBS. Vervang de PBS op monsters met blokkeeroplossing (2% runderserumalbumine (BSA) en 10% normaal geit serum (NGS) in PBS + 0,1% Tween-20) en incubeer O / N bij 4 ° C op een schudplatform. OPMERKING: Alle daaropvolgende wast en incubatie stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur op een schommelende platform, tenzij anders vermeld. Wash-oplossingen kunnen gemakkelijk worden veranderd met behulp van een fijne punt plastic of glas Pasteur pipet. Verdun het gewenste primaire antilichaam / antilichamen in werkende buffer (0,1% BSA, 0,3% NGS en 0,2% Triton X-100 in PBS). In dit voorbeeld verdunnen Dll1 en Notch1 antilichamen 1:25 in werkbuffer. LET OP: optimalisatie nodig zal zijn om de juiste verdunningsfactor nodig thi bepalens stap als alternatief antilichamen worden gebruikt. Incubeer explantaten in de antilichaamoplossing gedurende 3-5 dagen bij 4 ° C op een schudplatform. Zorg ervoor dat u een aantal voorbeelden met het werken buffer die geen primaire antilichaam op te treden als secundaire controles antilichaam bevatten. Herstel de primaire antilichaamoplossing in een 1,5 ml opslagbuis met een pipet en het op 4 ° C. OPMERKING: Teruggewonnen primaire antilichaam kan meerdere malen worden gebruikt, afhankelijk van het gebruikte antilichaam. 2 wasbeurten voeren van de monsters op 5-10 minuten elk in PBS, gevolgd door 3 wasbeurten van 10 minuten elk in 2% Triton X-100 in PBS bij kamertemperatuur op een schudplatform. Verdunnen fluorescent gelabelde secundaire antilichaam / antilichamen (epitoop afgestemd op het primaire antilichaam / antilichamen die) in werkende buffer. Voeg desgewenst 20 ug / ml Hoechst 33342 aan deze oplossing om de kernen tegenkleuring. OPMERKING: Optimalisatie kan nodig zijn om de juiste verdunningsfactor hoeft deze stap bepalen. In deze example, een verdunningsfactor van 1: 400 werd meestal gebruikt. Centrifugeer de secundaire antilichaamoplossing gedurende 10 minuten bij 16 xg om de vorming van antilichamen aggregaten voorkomen. Voeg 250-500 pl van het secundaire antilichaamoplossing elke monsterholte, verzorgen de laatste paar microliter van de oplossing, welk antilichaam aggregaten bevatten te gebruiken. Wordt het monster plaat met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te minimaliseren en incubeer de monsters in de secundaire antilichaamoplossing gedurende 3-5 dagen bij 4 ° C in het donker. Voordat proeven monteren, was de monsters tweemaal gedurende 10 min elk in 0,1% Tween-20 in PBS (PBST) en eenmaal gedurende 5 min in PBS bij kamertemperatuur op een schudapparaat (zie stap 4). 3. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) van PSM Explantaten Indien opgeslagen in een andere vat, draagt ​​de resterende contralaterale PSM explantaten aan de individuele putjes van een 24 putjes weefselkweekplaat. Was de monsters voor10 min in 50% ethanol in PBST, en voer vervolgens 2 wassingen gedurende 10 min elk in 100% ethanol op een schommelende platform bij RT om het weefsel te dehydrateren. OPMERKING: Alle daaropvolgende wast en incubatie stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur op een schommelende platform, tenzij anders vermeld. Hydrateren het weefsel door wassen gedurende 10 minuten in 50% ethanol in PBST, gevolgd door wassen tweemaal gedurende 5 minuten elk in PBST. OPMERKING: Stappen 3.2 en 3.3 noodzakelijk fixatie stappen vereist voor dit protocol en kan niet worden weggelaten. Incubeer de monsters met 10 ug / ml proteïnase K in 0,1% Tween-20 in PBS (PBST) gedurende 5 minuten zonder schudden. Snel verwijderen van de proteinase K en spoel de monsters kort met PBST voordat post-vaststelling van het weefsel gedurende 30 minuten in 4% formaldehyde + 0,1% glutaaraldehyde in PBST. LET OP: Zowel formaldehyde en glutaaraldehyde zijn giftig, en passende veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met deze oplossingen. OPMERKING: De volgende wassenen incubatiestappen met 50% en 100% hybridisatie mixen (stappen 3,6-3,9) worden uitgevoerd zonder roeren. Na wassen van de monsters tweemaal gedurende 10 min elk in PBST wassen monster eenmaal in 50% hybridisatiemengsel (geschikt voor intronic probes: 50% formamide, 5x zout-natriumcitraat (SSC), 5 mM EDTA, 50 ug / ml tRNA, 0,2% Tween-20, 0,1% SDS en 100 ug / ml heparine) in PBST bereid bij kamertemperatuur. Incubeer de monsters in deze oplossing gedurende 10 minuten bij 65 ° C zonder schudden. Spoel de monsters tweemaal met voorverwarmde (65 ° C) hybridisatiemengsel voordat de monsters te incuberen in hybridisatiemengsel gedurende ≥ 2 uur (tot 48 uur) bij 65 ° C (langere incubatietijden verbeteren het resulterende signaal-ruis contrast) . Verwijder de hybridisatie mix van de vorige stap, en vervangen 0,25-0,5 ml voorverwarmde (65 ° C) hybridisatiemengsel bevattende een digoxigenine (DIG) gemerkt anti-sense RNA-probe met een bekende segmentatie klokcomponent. NIETE: Zo werd een intron Lunatic fringe (Lfng (i)) probe gebruikt in een concentratie van 20 ul / ml op beginnende Lfng mRNA te detecteren. De verdunning die in deze stap probe-afhankelijk en zullen optimalisatie vereisen. Dicht de plaat middels plakband om verdamping te voorkomen en incubeer de monsters in de probe gedurende twee nachten bij 65 ° C. Met behulp van een fijne punt plastic Pasteur pipet, herstellen van de sonde voor hergebruik en op te slaan bij 20 ° C. Spoel de monsters tweemaal met voorverwarmde (65 ° C) na hybridisatiemengsel (50% formamide, 0,2% Tween-20, en 1 x SSC) voor het wassen van de monsters twee keer gedurende 20 min elk bij 65 ° C in pre- opgewarmd post-hybridisatie mix. Was de monsters gedurende 15 minuten bij 65 ° C in voorverwarmde 50% hybridisatiemengsel in 0,1% Tween-20 in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBST). Spoel de monsters tweemaal met TBST voor het wassen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in TBST op een schudplatform. Pre-incubeer de explantaten in blocking oplossing (TBST + 2% blokkerende buffer reagens (BBR) + 20% warmtebehandeld geit serum) gedurende minimaal 2 uur. Vervang deze oplossing met verse blokkerende oplossing die een 1: 200 verdunning van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam. Incubeer de monsters O / N bij 4 ° C. Na het antilichaam incubatie, spoel de monsters 3 keer met TBST bij kamertemperatuur en overbrengen naar individuele putjes van een nieuwe 24-well weefselkweekplaat. Was de explantaten met TBST 3 keer per 1 uur. Op dit punt, breng de monsters in 0,5 ml opslagbuizen of individuele putjes van een 48 putjes weefselkweekplaat het vereiste volume van het Tyramide signaalversterking (TSA) detectiereagentia in de volgende stappen te verminderen. Incubeer monsters TSA amplificatiebuffer (zie de lijst reagentia) bij KT gedurende 1 min zonder schudden gebruik zo klein mogelijk volume, zodat de monsters volledig ondergedompeld in de oplossing. Voeg TSA reagens (zie deLijst reagentia) om het monster amplificatie buffer bij een verdunning van 1:50. Vlug de oplossing te mengen totdat TSA reagens gelijkmatig verdeeld, bedek de platen of buizen in aluminiumfolie en incubeer de monsters gedurende 60-90 minuten in het donker. Verwijder de TSA amplificatie oplossing en was de monsters in TBST 3 maal gedurende 5 minuten elk. Breng de explantaten naar een 24-well weefselkweekplaat met het wassen in TBST volume verhogen en incubeer de monsters in 1% waterstofperoxide gedurende 1 uur. Was de monsters met TBST 3 maal gedurende 5 minuten elk, en daarna tweemaal gedurende 5 minuten elk met PBST voorafgaand monsters monteren (zie stap 4). 4. Monstervoorbereiding for Imaging Bereid een geladen adhesie glaasje per paar explantatie door toevoeging van 0,12 mm dik imaging afstandhouders, die voorkomen dat de monsters niet plat gedrukt door toevoeging van een dekglaasje. Verwijder de beschermfolie van het ene oppervlak van een afstandhouder en plaats deze klevende zijde naar beneden op een glasplaatje cursortoetsen firmly de spacer aan de dia af te dichten. LET OP: Voor de resterende stappen, zich inspannen om de monsters bij weinig licht of in het donker te houden aan fotobleken te voorkomen. Pipet explantaat paren op een voorbereide dia met een glazen Pasteur pipet in het centrum van de afstandhouder, zodat de ontleed zijde van het explantaat tegenover de slede. Schik contralaterale paren van explantaten naast elkaar. Verwijder zoveel vloeistof als mogelijk van de glijbaan met een glazen Pasteur pipet en lont uit het resterende vocht rondom de monsters met behulp van een stuk van gevouwen pluisarme vloeipapier. Laat de monsters te houden aan de glijbaan voor 45 – 60 s, totdat het weefsel begint kleverig en doorzichtig te verschijnen. Gedurende deze tijd, verwijder het resterende lijm voering van het tussenstuk met behulp van een tang. Sta niet toe dat de monsters te drogen. Voeg een grote druppel dubbele functie inbedmiddel en clearingoplossing (0,5% p-fenyleendiamine en 20 mM Tris, pH 8,8, in 90% glycerol) bij de monsters binnen het centrumvan de afstandhouder. LET OP: Deze oplossing wordt bruin / zwart wanneer toegestaan ​​om oxideren. Plaats voorzichtig een cirkelvormige dekglaasje (nr. 1.5) aan de overkant van de monsters, ervoor te zorgen dat de afdekmedium gelijkmatig wordt verdeeld en dat alle randen van het dekglaasje contact maken met de afstandhouder. Plaats het-cover gleed slide op zijn kop op een aantal low-lint vloeipapier. Stevig aandrukken zodat het dekglaasje volledig achter de afstandhouder en overtollig inbedmiddel wordt verwijderd. Herhaal dit totdat er geen meer inbedmiddel vlekken het papier. Schoon en het etiket van de dia ( 's) op de juiste wijze, en bewaar ze in het donker tot beeldvorming, op korte termijn bij -20 ° C of op lange termijn bij -80 ° C. Na het verwijderen van de dia's uit de opslag, zodat zij volledig ontdooien voor de beeldvorming. Het imago van de gemonteerd monsters met behulp van een confocale microscoop met betegelde overname en een hoog doel vergroting. Afbeelding het explantaat paren met een 40x olie-immersie objectief bij 4 pm z-intervallen middels 488 nm, 568 nm en 647 nm laser-lines om de groene, rode en ver-rode fluoroforen, respectievelijk gebruikt voor eiwit- en mRNA detectie in dit onderzoek 12 wekken. LET OP: Betegelde beelden werden gestikt na de overname tot een enkel beeld voor analyse vormen. 5. Post-acquisitie Image Analysis Met beeldanalyse software om een ​​gebied van belang in de PSM van elke experimentele monster bepalen. Om expressieniveaus, subtract achtergrond en drempel beelden kwantificeren van het niveau van een niet-primaire controlemonster vóór verder kwantificatie. Definieer een oorsprong, een as, en een lengte-eenheid voor elk monster. Bereken de fluorescentie-intensiteit als functie van positie langs het genormaliseerde rostro-caudale as voor elk van de M 12 monsters. Na normaliseren van de intensiteit percelen, plaats de intensiteitsprofielen naast elkaar en krijgen een intensiteit matrix f (i, j) de intensiteit op de i beschrijft <sup> th ruimtelijke positie in de jde monster. 6. Temporal bestellen van Monsters Temporele bestelling van een bekende klokcomponent afleiden definieert de intensiteit matrix. Vervolgens volgorde van de kolommen van de matrix intensiteit teneinde een in de tijd periodiek patroon te verkrijgen. Om dit te doen, bepalen de functie waarin A (fj; k) representeert de autocorrelatiefunctie van de jde kolom F en A T een doelwit autocorrelatiefunctie gekozen aanwezig om de periodiciteit van het patroon af te dwingen, gegeven door Gebruik Metropolis-Hastings (of een andere minimalisering algoritme) 12 om de volgorde van de monsters die de functie g minimaliseren identificeren. Aldus bepalen de volgorde van deM monsters die de temporele periodiciteit van een bekende klok component maximaliseert. Met behulp van de afgeleide temporele volgorde van de M monsters, bouwen een geordende kymograaf voor de expressie patroon in de gepartnerde kanaal 12.