الاستفادة المثلى من الكمية الصغيرة تحييد الفحص
Summary
توضح هذه الدراسة القائم على التصوير مقايسة تحييد الدقيقة لتحليل العلاقات بين المستضدات الفيروسات. بروتوكول توظف الماسحة الضوئية المسطحة، ولها أربع خطوات، بما في ذلك المعايرة، الكميات المعايرة، تحييد، والكميات التعادل. الفحص يعمل بشكل جيد مع الحالي تعميم الأنفلونزا A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
وتستخدم الجزئي إبطال مفعول (MN) فحوصات في علم الفيروسات لتحديد الكميات من تحييد الأجسام المضادة والأنشطة المضادة للفيروسات. كبديل لتثبيط التراص (مرحبا) المقايسات، المقايسات MN يمكن التغلب على الآثار غير مولدة تتأثر بالتغيرات تقارب مستقبلات ملزم في فيروسات الأنفلونزا، والتي يمكن أن تعقد تفسير مرحبا النتائج 1،2،3. حتى وقت قريب، واستندت معظم فحوصات MN على آثار الاعتلال الخلوي (CPE) أو المقايسات المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) 4،5. وقد وضعت فحوصات MN على أساس التركيز والبلاك تخفيض في عام 1990 6،7،8. فحوصات للحد من اللطخ تعتمد على عد لويحات واضحة لتحديد العدوى. ومع ذلك، تعول البصرية تغطي سوى اللوحات الكبيرة التي هي للحل من قبل العين البشرية، على الرغم من أن الغالبية العظمى من لويحات صغيرة وغير مرئية للعديد من الفيروسات المنتشرة الحالية. هذه التغطية غير مكتملة يمكن أن يسبب تفاوتا واضحا بين الممتحنين وبين التجارب، مما يؤدي إلى iالنتائج ncomparable. ومن المستحيل أيضا استخدام الأسلوب عندما يظهر بعض الفيروسات العدوى فاشلة من الخلايا واحد أو لويحات صغيرة جدا.
ويمكن تحسين دقة العد الفقراء من خلال إدخال بروتوكول القائم على التصوير. مع التقدم في التكنولوجيا، والمجهر الضوئي والإنتاجية العالية يمكن للقراء جيدا لوحة توفر وسائل دقيقة لعدد الخلايا المصابة 9. تحت المجهر عبر مضاءة، الخلايا المصابة ذات الكلمات الدلالية مع بعض علامات يمكن تصور بواسطة امتصاص أو مضان المقابل لها في قرار الفرعية الخلوية. ومن ثم يمكن تحليلها عينة على شاشة الكمبيوتر.
للأسف، بسبب قيود في مجال الرؤية، يطلب أكثر من مائة الصور بالبلاط لتغطية بئر واحدة. ان تحليل لوحة مع 96 بئرا تتطلب التصوير وتجهيز حوالي عشرة آلاف من الصور. هذه العملية شاقة هي مضيعة للوقت ومكلفة، والقرار المكتسبة في أجناسل لا لزوم له لتوصيف روتينية من العدوى الفيروسية. مختبرات بميزانية محدودة قد تجد أن النهج تتمحور حول الماسحة الضوئية المسطحة يوفر، بديلا فعالا من حيث التكلفة الإنتاجية العالية.
في هذه الورقة، ونحن تصف تحسين الحد من الترسبات MN الفحص التي هي مناسبة لتوصيف الأنتيجين عدد كبير من الفيروسات ولقياس كميا الأنشطة المضادة للفيروسات والأجسام المضادة التعادل. فحص ديها العديد من المزايا: أولا، هو فحص القائم على التصوير التي هي قادرة على قياس العدوى بالفيروس على المستوى الخلوي، بغض النظر عن حجم اللوحة. عد مجموع السكان الخلية المصابة (ICP) داخل بئر يزيد من حساسية الكشف، مما يجعل من الممكن لتوصيف الفيروسات مع العدوى منخفض. ثانيا، يتم إدخال المعايرة الكمية أكثر دقة قبل تحييد لتحديد كمية الفيروس الإدخال. فيروس المدخلات الكمي يقلل بشكل ملحوظ من فاريانشوئها بين مختلف التجارب ويجعل النتائج أكثر قابلية للمقارنة بين المختبرات. ثالثا، التتر تحييد يمكن تحديد بشكل مباشر من خلال تحليل الصور، مما يجعل الكميات سريع وسهل الاستعمال. وأخيرا، يقدم بروتوكول بديلا فعالا من حيث التكلفة والإنتاجية العالية لهذا القرار المطلوبة والدقة. ويستند الكميات على الماسحة الضوئية المسطحة والبرمجيات الحرة معالجة البيانات. الإعداد كله لديه بصمة صغيرة وهو الانتشار في معظم المختبرات.
بروتوكول المعروضة في هذه الورقة يتكون من أربع خطوات رئيسية، بما في ذلك المعايرة فيروس، الكميات المعايرة، تحييد الفيروس، وتحديد الكميات التعادل. فيروس المعايرة هي تجربة إعداد الذي يحدد كمية الفيروسات المدخلات التي ستستخدم في التعادل. خلال المعايرة، يتم تطبيق عدد من تركيزات الفيروسية إلى الطبقات الوحيدة الخلية في لوحة 96-جيدا. ثم يتم quantitated الخلايا المصابة في القسم 2. dilu الفيروسينشوئها التي تنتج 20٪ -85٪ ICP وبدوره تطبق على الفيروسات مساهمة في تحييد المقابلة في القسم 3. كميا والتتر من بروتوكول تحييد باستخدام القسم 4. التجارب التي تلت يتم عرض البروتوكولات المذكورة أعلاه في ممثل النتائج. وقد تم اختبار فحص دقيق خلال العامين الماضيين مع معظم فيروسات الأنفلونزا المنتشرة الحالية، مثل A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B. وقد أدرجت نتائج توصيف فيروس الانفلونزا في التقارير عن الاجتماع التشاوري لمنظمة الصحة العالمية التي أعطت توصيات بشأن لقاحات الأنفلونزا للاستخدام في نصف الكرة الجنوبي في عام 2016 وفي نصف الكرة الشمالي في 2016-2017.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، وصفنا لMN فحص القائم على التصوير لتحديد العلاقات مولدة الحقيقية بين الفيروسات. مقارنة مع فحوصات أخرى للحد من اللوحة، وطريقة تؤكد قياس برنامج المقارنات الدولية من بئر بأكمله، وضمان تغطية كاملة من السكان عدوى. استقلالها من تشكيل الترسبات أيضا يوسع تطبيق الفحص للفيروسات التي يمكن أن تشكل ويحات صغيرة أساسا غير مرئية أو التي يمكن أن تدير فقط إصابة وحيدة الخلية. ولذلك، فإن الاختبار هو قادرة على فحص المزيد من الفيروسات وآثار مجموعة واسعة من الأجسام المضادة من مرحبا، وأنه يساعد على التفكير بشكل أكثر شمولية أوجه التشابه المستضدات أو الاختلافات بين الفيروسات 12. على سبيل المثال، عندما يتم تضمين الكربوكسيل الدواء، وفحص MN هو أقل تأثرا NA-تعتمد ملزمة، مما يعكس الاختلافات مولدة بشكل أكثر دقة. خلال تطوير الفحص، وقد بذلت جهود كبيرة لتعزيز تجربة الاتساق، والسرعة، وكشفحساسية، بما في ذلك عن طريق التحكم في مدخلات الفيروسات من خلال المعايرة quantitated، والتصوير في إنتاجية عالية والماسحة الضوئية المسطحة، وتنفيذ تجهيز منصة البيانات سهل الاستعمال. وكانت النتائج دائما ما تتفق مع وأكدت تلك مرحبا. والجدير بالذكر، كما كشفت نتائج الخلافات المستضدات بين المتغيرات الانجراف مولدة من نوع A و قاح B الفيروسات الأخيرة، فضلا عن التغيرات المستضدات التي تسببها التغيرات مختارة ثقافة أو متفرقة، مثل استبدال G155E في HA1 بعض A (H1N1) فيروسات pdm09 12.
بروتوكول مطابقة لنوع الفيروس أو سلالة مع اختيار خطوط الخلايا التي أعطت أقوى عدوى، مما ساهم كثيرا في إشارة التصوير. وقد مهد الاختلاف تجريبية مع تصميم التكرارات التي متوازنة مع عدد من أمصال مضادة اختبارها. يمكن الشكوك تأتي أيضا من جودة الصورة، والتي أثرت بشكل رئيسي من قبل جهاز التصوير. ولائق اللون مسطحة الماسح الضوئي يمكن جوهريficantly تحسين تباين الصورة والحد من الضوضاء. كمية الفيروس مساهمة في تحييد يجب أن يتم تحديدها كميا مقدما من المعايرة المقابلة في حين أن الفيروسات لا تزال تحافظ على حكمهم. خلال تحييد، واستجابة مصل مضاد للعدوى هي تطبيع ضد الفرق بين الفيروس المرجعية (VC) ومستوى الخلفية (CC). قياسات دقيقة من VC وCC ضرورية لتجربة التعادل. ينصح المزيد من التكرارات (استخدمت ثمانية تكرارات في ممثل النتائج). وأخيرا، فهم البرنامج هو أمر حيوي لنجاح التجربة. وقد تم اختبار البرنامج لتوصيف فيروس روتيني في مركز الإنفلونزا منظمة الصحة العالمية، المملكة المتحدة لأكثر من عامين. وتقدم الإرشادات التفصيلية للتعامل مع مختلف الحالات في S1 التكميلية.
هذا الاختبار MN غير مناسبة للتطبيقات حيث تغطي عينات من تحويلةحقل كبير remely نظر ولكن فقط يتطلب القرار التصوير المعتدل. تكلفة منخفضة والإعداد بسيطة تجعل من نظام متاحة بسهولة في معظم المختبرات وعلم الفيروسات. وكان الاختلاف في القياسات لنفس العينة أقل من 3٪، والذي يحدد ما يقرب من حالة عدم اليقين التي قدمت خلال المسح 11. هذا التكاثر غير كافية في العديد من الدراسات الفيروسية ويمكن لمزيد من التقليص عن طريق حساب متوسط الصور من مسح متعددة.
في الختام، توضح هذه الدراسة فحص MN القوي التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في دراسة مستضدية ودعم البيانات مرحبا في تحليلات مفصلة لعرضه-فيروسات الإنفلونزا، لا سيما لاختيار نصف سنوية من الفيروسات لإدراجها في لقاحات الأنفلونزا البشرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening – Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
