Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations
Summary
Diese Studie beschreibt ein Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
Mikroneutralisation (MN) Assays werden in der Virologie für die Quantifizierung von neutralisierenden Antikörpern und antivirale Aktivitäten. Als Alternative der Hämagglutinations – Inhibitions (HALLO) -Assays können MN – Assays überwinden nicht-antigen durch die Affinitätsänderungen Rezeptorbindungs in Influenza – Viren beeinflusst Effekte, die die Interpretation der Ergebnisse HALLO 1,2,3 erschweren können. Bis vor kurzem wurden die meisten MN Assays basierend auf cytopathische Effekte (CPE) oder Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN – Assays auf Basis von Fokus und Plaque – Reduktion wurden 1990 6.7.8 entwickelt. Plaque-Reduktionstests beruhen auf Zählen sichtbare Plaques Infektiosität zu quantifizieren. Jedoch visuelle zählt decken nur große Plaques, die durch das menschliche Auge auflösbare sind, obwohl die Mehrheit der Plaques sind klein und unsichtbar für viele aktuelle zirkulierenden Viren. Diese unvollständige Abdeckung kann erhebliche Unterschiede zwischen den Prüfern und zwischen den Experimenten führen, was zu incomparable Ergebnisse. Es ist auch nicht möglich, die Methode zu verwenden, wenn einige Viren abortive Infektion einzelner Zellen zeigen oder sehr kleine Plaques.
Die schlechte Zählauflösung kann durch die Einführung eines bildbasierten Protokolls verbessert werden. Mit den Fortschritten in der Technologie, optische Mikroskopie und Hochdurchsatz – Well-Platte Leser können genaues Mittel zur Verfügung stellen , die infizierten Zellen 9 zu zählen. Unter einem trans beleuchtet Mikroskop, mit bestimmten Markern markiert infizierten Zellen können durch ihre Absorption oder Fluoreszenzkontrast in subzellulärer Auflösung visualisiert werden. Eine Probe kann dann auf einem Computer ausgewertet werden.
Leider aufgrund der Beschränkung auf das Sichtfeld, mehr als hundert gekachelte Bilder eine einzelne gut zu decken sind erforderlich. eine Platte mit 96 Vertiefungen Analyse würde die Bildgebung und Verarbeitung von etwa zehntausend Bilder erfordern. Solch ein mühsamer Prozess ist zeitaufwendig und teuer, und die Auflösung in den Gattungen gewonnen istl unnötig für Routine Charakterisierung von viralen Infektionen. kann Laboratories mit einem begrenzten Budget zu finden, dass die rund um einen Flachbettscanner gebaut Ansatz eine kosteneffektive bietet, Hochdurchsatz-Alternative.
In diesem Papier beschreiben wir eine verbesserte Plaquereduktions MN-Assay, der für die antigenen Charakterisierung einer großen Anzahl von Viren und zur quantitativen Messung der antiviralen Aktivitäten und Neutralisationsantikörper geeignet ist. Der Assay hat mehrere Vorteile: Zum einen ist es eine Abbildungsbasierten Assay, der, unabhängig von Plaquegröße in der Lage, Virus-Infektionen auf zellulärer Ebene zu messen. Zählen der Gesamt infizierte Zellpopulation (ICP) in einem gut erhöht die Erfassungsempfindlichkeit, die es ermöglichen, die Viren mit geringen Infektiosität zu charakterisieren. Zweitens wird eine genauere quantitative Titration vor der Neutralisation eingeführt, um die Menge von Eingangs Virus zu bestimmen. Die quantitative Eingangs Virus reduziert signifikant die variation zwischen verschiedenen Experimenten und stellt die Ergebnisse besser vergleichbar zwischen den Laboratorien. Drittens kann Neutralisationstiter direkt Bilder durch die Analyse bestimmt werden, so dass die Quantifizierung schnell und benutzerfreundlich. Schließlich bietet das Protokoll eine kostengünstige und Hochdurchsatz-Alternative mit der erforderlichen Auflösung und Genauigkeit. Die Quantifizierung basiert auf einem Flachbettscanner und kostenlose Software zur Datenverarbeitung. Die gesamte Einrichtung hat eine kleine Stellfläche und ist einsetzbares in den meisten Labors.
Das Protokoll in diesem Papier besteht aus vier Hauptschritten, einschließlich Virus-Titration Titration Quantifizierung, Virusneutralisations- und Neutralisierung Quantifizierung. Virustitration eine Zubereitung Experiment, das die Menge von Eingangs Viren bestimmt in der Neutralisation verwendet werden. Während einer Titration wird eine Anzahl von viralen Konzentrationen zu den Zellmonoschichten in einer Platte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Die infizierten Zellen werden dann in Abschnitt 2. Die virale Dilu quantifizierttion, die 20% bis 85% erzeugt wird ICP wiederum als Input-Viren auf die entsprechende Neutralisierung angewendet in Abschnitt 3. Die Titer des Neutralisierungsprotokolls werden quantifiziert Abschnitt mit 4 Experimente, die die oben genannten Protokolle befolgt werden in den Repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Der Test wurde mit den meisten der aktuellen zirkulierenden Influenza-Viren, wie beispielsweise A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B Viren gründlich in den letzten zwei Jahren getestet. Die Ergebnisse der Influenza-Virus-Charakterisierung wurden in den Berichten für das WHO-Konsultationstreffen einbezogen, die in 2016-2017 im Jahr 2016 und der nördlichen Hemisphäre Empfehlungen für Influenza-Impfstoffe für den Einsatz in der südlichen Hemisphäre gab.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir beschrieben, eine Bildgebungsbasis MN Assay die wahren antigen Beziehungen zwischen Viren zu quantifizieren. Im Vergleich zu anderen Plaque-Reduktions-Assays, betont Messung der Methode der ICP eines ganzen gut, die vollständige Abdeckung der Infektions Bevölkerung zu gewährleisten. Die Unabhängigkeit der Plaquebildung erweitert auch die Anwendung des Tests auf Viren, die in erster Linie unsichtbar kleine Plaques bilden kann, oder dass nur Single-Cell-Infektion zu verwalten. Daher ist der Assay der Lage mehr Viren und die Auswirkungen einer breiteren Palette von Antikörpern als HALLO untersuchen, und es hilft zu umfassender die antigenen Ähnlichkeiten oder Unterschiede zwischen Viren 12 reflektieren. Wenn beispielsweise Oseltamivircarboxylat enthalten ist, wird der MN-Assay weniger von NA-abhängige Bindung, was die antigenen Unterschiede genauer. Während der Entwicklung des Assays, wurden große Anstrengungen unternommen, den Versuch Konsistenz, die Geschwindigkeit und die Erkennung zu verbessernEmpfindlichkeit, auch durch Eingabe Viren durch Titration quantifiziert, Bildgebung in hohem Durchsatz mit einem Flachbettscanner zu steuern, und eine benutzerfreundliche Datenverarbeitungsplattform implementiert. Die Ergebnisse haben mit konsistenten allgemein gewesen und denen der HALLO bestätigt. Bemerkenswerterweise zeigten die Ergebnisse auch antigenische Unterschiede zwischen Antigendrift Varianten der letzten Typ A und B-Impfstoff-Viren sowie antigen Veränderungen durch kultur ausgewählt oder sporadische Änderungen, wie beispielsweise die G155E Substitution in HA1 bestimmter A (H1N1) pdm09 Viren 12.
Das Protokoll entsprach dem Virus Typ oder Subtyp bei der Auswahl von Zelllinien, die die stärkste Infektion gab, die stark das Abbildungssignal verstärkt. Experimentelle Variation wurde mit der Konstruktion von Duplikaten geglätteten, die mit der Anzahl der getesteten Antiseren ausgewogen. Ungewißheiten kann auch von der Bildqualität kommen, die im Wesentlichen durch die Abbildungsvorrichtung beeinflusst wird. Ein anständiger Farbflachbettscanner kann signinifikant den Bildkontrast zu verbessern und den Lärm zu reduzieren. Die Menge des eingesetzten Virus in der Neutralisation muß quantitativ aus dem entsprechenden Titration im Voraus bestimmt werden, während die Viren noch einen ähnlichen Zustand zu erhalten. Während der Neutralisation wird das Antiserum Antwort auf eine Infektion normalisiert gegen die Differenz zwischen dem Referenzvirus (VC) und der Hintergrundebene (CC). Genaue Messungen von VC und CC sind unerlässlich, um eine Neutralisierungs Experiment. Mehr Duplikate werden empfohlen (acht Duplikate wurden in den Repräsentative Ergebnisse verwendet). Schließlich wird die Software das Verständnis entscheidend für den Erfolg eines Experiments. Die Software wurde für die Routineviruscharakterisierung in der WHO-Zentrum für Influenza, Großbritannien für mehr als zwei Jahren getestet. Detaillierte Anleitungen für den Umgang mit verschiedenen Situationen in der Zusatz S1 vorgesehen.
Dieser MN-Assay eignet sich für Anwendungen, bei denen die Proben eine ext deckenremely großes Sichtfeld, sondern nur erfordern moderate Bildauflösung. Die niedrigen Kosten und einfache Installation machen das System leicht an die meisten Virologie Laboratorien zur Verfügung. Die Variation in Messungen derselben Probe betrug weniger als 3%, was die Unsicherheit während des Abtastens definiert ungefähr 11 eingeführt. Eine solche Reproduzierbarkeit ist in vielen virologischen Untersuchungen ausreichend und kann weiter durch Mittelung der Bilder mehrerer Scans reduziert werden.
Abschließend zeigt diese Studie eine robuste MN-Assay, die routinemäßig in der Antigen-Studie verwendet werden kann und HALLO Daten in detaillierte Analysen der aktuell zirkulierenden Influenzaviren, insbesondere für die alle zwei Jahre Auswahl von Viren für die Aufnahme in den menschlichen Influenza-Impfstoffen zu unterstützen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
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